本发明专利技术涉及一种利用吸水链霉菌累积生产西罗莫司的方法，将吸水链霉菌接种到种子培养基中，30℃条件下活化培养60h，然后按接种量为6wt％将吸水链霉菌接种到发酵罐中，在发酵前期即在菌体生长阶段，发酵8h后进行指数流加葡萄糖，控制比生长速率在0.02/h-0.06/h，进行高细胞密度培养，获得较高的菌体浓度；发酵32h后进入发酵中后期，通过恒速流加前体物莽草酸和L-赖氨酸，为合成西罗莫司提供前体物，提高其发酵水平。与现有技术相比，本发明专利技术合成得到的西罗莫司最高效价可达700mg/L，比分批发酵提高约30％，这种发酵策略控制简单、西罗莫司产量较高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种生产西罗莫司的方法，尤其是涉及。
技术介绍
西罗莫司(Sirolimus，SRL)，原名雷帕霉素(Rapamycin，RPM)。是由三i^一元环组成的含氮三烯大环内酯类抗生素。是一种具有抗真菌、抗增殖抗肿瘤作用的新型强效免疫抑制剂。1975年，Ayerster实验室从太平洋Ester岛(Raps Nui) 土壤中分离得到吸水链霉菌(Sti^ptomyces hygroscopicus)产生的西罗莫司。西罗莫司最初确定为一种抗真菌抗生素，1977年发现其具有重要的免疫抑制作用，1989年开始把其作为用于抗器官移植排斥反应的新型高效免疫抑制剂进行研究，目前(2010年)RAPA的I、II期临床试验已结束，III期临床试验正在进行之中。1999年9月美国FDA批准其适用于在临床上的肾移植病人。在中国，西罗莫司口服液作为二类新药2002年获准进入国内临床。2005年6月福建省微生物研究所研制研发的国产西罗莫司经SFDA批准投放市场。现在西罗莫司已成功开发为新型强效的免疫抑制剂，用于器官移植抗排斥反应，用于治疗自身免疫性疾病；用于涂层支架，防止心脏血管再狭窄；作为roTOR靶向抗肿瘤药物，抑制肿瘤的生长等。西罗莫司及其的衍生物CCI-779、AP23573和RAD001正开发为靶向、低毒的抗肿瘤药物。西罗莫司作为免疫抑制剂的机制在雷帕霉素通过不同的细胞因子受体阻断信号传导，阻断T淋巴细胞活化的后期反应(增殖)，抑制细胞从Gl期进入S期，阻断白细胞介素-2 (IL-2)与其受体的结合，使Tc、Td细胞不能成为具有免疫因答作用的致敏性T淋巴细胞，从而发挥其免疫作用。目前西罗莫司的生产主要是采用发酵的方法，其发酵过程有以下特点(1)发酵过程分为菌丝生长和西罗莫司生产两个阶段。( 发酵液粘度极高，当发酵过程供氧不足时，西罗莫司的生产将停止(徐亲民，国外医药抗生素分册，2000)。据国内外文献报道不同的碳源，氮源，以及无机盐的种类和含量与西罗莫司的生产有密切关系。Y. R. Cheng等 (Y. R. Cheng et, al, MicrobioL, 1995)研究了 ；磷酸盐及金属离子等对菌体生长和雷帕霉素产物累的作用。磷酸盐对菌体的生长和产物的形成关系密切，浓度大于IOmM的磷酸盐会阻碍菌体生长并影响产物的形成。美国麻省理工学院Arnold A · Demain教授等的研究已表明西罗莫司大环内酯是由6个乙酸和7个丙酸单位所组成，3个甲氧基来自蛋氨酸的甲基。果糖、赖氨酸可以促进西罗莫司的生物合成，(NH4)2SO4和外源蛋氨酸反而对SRL的生物合成产生负影响。2000年又发现L 一蛋氨酸减低SRL产量，但提高去甲基一 SRL (副产物)产量，2004年，印度学者Vaid等即对一株链霉菌进行诱变，将植物油作为惟一碳源进行发酵，结果表明连续发酵144 192h，西罗莫司的产率可达到180 330mg/L ；印度科学家(RarAax et al，200 从土壤中筛选了高产西罗莫司链霉菌，且副产物极少，在高通气量的糊精培养基中通过补料分批发酵产生了 300 310mg/L的西罗莫司；顾骏等(顾骏等，华东理工大学学报(自然科学版)，2007)在发酵初期添加2. 5g/L的异亮氨酸(lie)，结果西罗莫司产量提高了约59%。陈希杨等(陈希扬等，化学工程，2011)研究了西罗莫司发酵的最佳种子培养时间，发现60h的种子液能够产生最高的发酵水平。系统地考察了发酵培养基中不同水平的碳氮源和各种无机盐对西罗莫司发酵水平的影响，并确定最优的培养基配方。作为新型强效免疫抑制剂，西罗莫司具有广阔的应用前景。但是，国内外文献报道的吸水链霉菌发酵生产RPM的水平都较低，大多在100-300mg/L。国内外研究进展发现西罗莫司的发酵生产存在原始菌株产西罗莫司能力低下、发酵周期长、中间产物多、高浓度产物和底物抑制、发酵液分离提取复杂等问题，因此很难实现产业化。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种有利于提高西罗莫司产量、快速产生西罗莫司、操作简单、效价较高的利用吸水链霉菌累积生产西罗莫司的方法。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现，其特征在于，该方法包括取 ISP3斜面种子用20wt%甘油洗脱孢子形成孢子悬浊液，按2wt%接种量将孢子悬浊液接种到种子培养基中，控制温度为30°C下活化培养60h，长成得到吸水链霉菌(Sti^ptomyces hygroscopicus)，然后按接种量为6wt%将吸水链霉菌接种到发酵罐中，发酵罐初始采用的培养基为优化后的葡萄糖-甘油双碳源液体培养基，发酵前期为葡萄糖指数流加发酵，发酵中后期为前体物补料流加，用缓冲液控制PH稳定在5. 7-6. 3，培养得到西罗莫司。所述的ISP3斜面种子包括以下组分及含量燕麦片2g/L、琼脂粉2g/L，溶剂为蒸馏水。所述的种子培养基包括以下组分及含量葡萄糖(C6H12O6 · H2O) 10. 0-15. Og/ L、蛋白胨3. 0-6. Og/L、酵母提取物3. 0-6. Og/L、酪蛋白水解物1. 5-2. 5g/L、硫酸镁 (MgSO4 · 7H20)0. 25-0. 5g/L、磷酸氢二钾(K2HPO4) 1. 0-1. 5g/L，溶剂为蒸馏水，种子培养基的 PH 值为 6. 5-7. 5。所述的优化后的葡萄糖-甘油双碳源液体培养基包括以下组分及含量葡萄糖 15. 0-20. Og/L、甘油 5. 0-10. 0g/L、黄豆饼粉 5. 0-10. 0g/L、酵母提取物 3. 0-6. 0g/L、 蛋白胨 2. 0-3. 0g/L、磷酸二氢钾(KH2PO4) 2. 5-5. 0g/L、磷酸氢二钾(K2HPO4) 2. 5-5. 0g/L、 氯化钠(NaCL) 4. 0-5. 0g/L、L-赖氨酸 1. 4-2. 0g/L、硫酸亚铁(FeSO4) 1. 5-2. 0g/L、硫酸镁 (MgSO4 · 7H20) 2. 0-2. 5g/L，溶剂为蒸馏水，pH 自然。所述的发酵前期为发酵达到32小时，期间向发酵罐中指数流加葡萄糖，所述的发酵中后期向发酵罐中恒速补加前体物，用缓冲液调节发酵罐中的发酵液PH稳定在 5. 7~6. 3 ο所述的发酵前期待发酵他后，指数流加葡萄糖，控制比生长速率为0. 02-0. 06/h。所述的补加前体物包括以下组分和补料速率莽草酸浓度为2_4g/L，补料速度为 500mg/L ·天，L-赖氨酸浓度为l_2g/L，补料速度为250mg/L ·天。所述的缓冲液为浓度0. 5mol/L的K2HPO4及0. 5mol/L的KH2PO4构成的缓冲液。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点1)发酵第一阶段通过指数流加葡萄糖控制菌体的比生长速率来达到更高的菌体密度；2)发酵第二阶段通过补前体物莽草酸和L-赖氨酸，有利于提高西罗莫司产量；3)发酵第二阶段通过补葡萄糖调控pH，有利于快速产生西罗莫司；4)西罗莫司效价较高，最高可达700mg/L，接近于目前国际报道的最高值，本专利技术为实现西罗莫司的大规模生产提供了一种有效方法。附图说明图1为实施例1中产品的发酵曲线。 具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术进行详细说明。本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种利用吸水链霉菌累积生产西罗莫司的方法，其特征在于，该方法包括：取ＩＳＰ３斜面种子用２０ｗｔ％甘油洗脱孢子形成孢子悬浊液，按２ｗｔ％接种量将孢子悬浊液接种到种子培养基中，控制温度为３０℃下活化培养６０ｈ，长成得到吸水链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ），然后按接种量为６ｗｔ％将吸水链霉菌接种到发酵罐中，发酵罐初始采用的培养基为优化后的葡萄糖－甘油双碳源液体培养基，发酵前期为葡萄糖指数流加发酵，发酵中后期为前体物补料流加，用缓冲液控制ｐＨ稳定在５．７－６．３，培养得到西罗莫司。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孙爱友，魏东芝，王丽华，董玉国，徐瑞，俞鹏飞，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：31
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