本发明专利技术公开了胰岛素Ｂ链ＨＬＡ－Ａ＊０２０１限制性ＣＴＬ表位改造肽配体（ＡＰＬ）及其获得方法和应用，该ＡＰＬ的氨基酸序列为ＨＬＣＧＰＦＬＶＥＡ，是将天然表位ｍＩｎｓＢ５－１４的第６位组氨酸替换为苯丙氨酸而得；其获得方法是先建立ＴＣＲ－ＨＬＡ－Ａ＊０２０１－ｍＩｎｓＢ５－１４复合物模型，确定ｍＩｎｓＢ５－１４中潜在的ＴＣＲ作用位点并对其进行单氨基酸突变，从中筛选出与ＨＬＡ－Ａ＊０２０１分子亲和力高于天然表位且空间构象和天然表位接近的候选ＡＰＬ，再进一步通过细胞功能实验从中鉴定出能显著下调ｍＩｎｓＢ５－１４特异性ＣＴＬ应答水平的ＡＰＬ，即得；本发明专利技术ＡＰＬ可用于制备Ｉ型糖尿病治疗性负调肽疫苗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种改造肽配体(altered peptide ligand, APL)，特别涉及胰岛素B 链HLA-A*0201限制性CTL (细胞毒性T淋巴细胞)表位mInsB5_14的APL，还涉及该APL的 获得方法和应用。
技术介绍
I型糖尿病(Type I diabetes)是由淋巴细胞介导的以胰岛0细胞特异性损伤 导致胰岛素生成绝对不足为特征的一种自身免疫性疾病。I型糖尿病多发生在儿童和青少 年，起病急，如不及时治疗可引发累及心、肝、肾、神经、眼等重要组织器官的严重并发症，是 儿童和青少年致残及早亡的主要原因之一。近年来，我国儿童和青少年患I型糖尿病的人 数逐年递增，I型糖尿病正在成为危害我国儿童和青少年健康的主要疾病。目前，I型糖 尿病以胰岛素终身替代疗法和非特异性免疫抑制为主要治疗手段，治疗费用高昂且副作用 大，因此，急需建立一种特异性免疫干预治疗策略。大量动物实验证实，给非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠口服或接种自身抗原，可以减 缓甚至完全阻断I型糖尿病的发生、发展。既往研究发现，不管是糖尿病患者还是NOD小鼠， 自身反应性Thl细胞在I型糖尿病的致病机制中占中心地位，因此，近年来发展了用自身反 应性CD4+T细胞表位替代完整自身抗原来诱导免疫耐受的策略。相对于结构复杂的大分子 天然抗原，小分子表位肽具有更易诱导免疫耐受、相对安全、易于实现规模化制备和纯化等 优点，最为重要的是可以通过一些氨基酸位点的化学修饰最大限度地增强其免疫调节的能 力。例如，源于胰岛素B链的mInsB9_23是优势性自身反应性⑶4+T细胞表位，Alleva等采 用丙氨酸突变扫描技术筛选出一条将mInsB9_23的第16位和第19位氨基酸同时替换为丙 氨酸的APL，该APL免疫NOD小鼠后可以有效诱导Thl — Th2型应答转换，从而阻断I型糖 尿病的发生。源于热休克蛋白60的Hsp6 0437_46(1也是一个优势性自身反应性CD4+细胞表位， Raz等将其第6位和第11位的氨基酸同时替换为缬氨酸后获得了一条稳定性更强的APL， 该APL可以有效诱导Thl —Th2型应答转换，在一定程度上减轻或者阻断0细胞的免疫损 伤，但临床研究显示其对I型糖尿病的防治效果却因人而异，可能是由于免疫应答类型转 换在尺度上很难把握，一旦Th2辅助的体液免疫过分加强后，疾病最终转归则变得难以预 料，这使得以调节⑶4+T细胞应答为目的的免疫干预策略陷于尴尬境地。近年来在NOD小鼠模型研究中有愈来愈多的证据表明自身反应性CD8+T细胞(即 CTL)在I型糖尿病中同样具有十分重要的致病作用，其识别0细胞上的自身抗原CTL表位 与MHC-I类分子形成的复合物，通过Fas/FasL、释放穿孔素等途径直接杀伤0细胞。已有 研究利用自身抗原CTL表位或其APL在NOD小鼠体内成功诱导了特异性CTL免疫耐受，对 I型糖尿病有一定的防治作用。同时研究报道，I型糖尿病的发生与人类HLA_A*0201分子密切相关。据统计，约 60%的I型糖尿病患者携带HLA-A*0201等位基因。在HLA_A*0201转基因N0D小鼠中，I型糖尿病的发病时间较普通NOD小鼠提前 且程度加重，是良好的人源化动物模型。近年来已陆续鉴定出一系列人和小鼠I型糖尿病 自身抗原HLA-A*0201限制性CTL表位，其中部分存在较高的人、鼠交叉反应性。因此，利用 人源化NOD小鼠筛选对自身反应性CTL具有负调节效应的APL，对于人类I型糖尿病的防治研究具有重要意义。在人源化NOD小鼠中，源于胰岛素B链的mInsB5_14(即鼠源胰岛素B链第5到14 位氨基酸)已被证实为HLA-A*0201限制的免疫优势性CTL表位，且与人源表位具有高度的 交叉反应性。因而，通过改造天然表位111111纽5_14来获得在HLA-A*0201背景下能显著下调 mInsB5_14特异性CTL应答水平的APL，对于人类I型糖尿病的防治研究具有重要的实际意 义和良好的应用前景。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种胰岛素B链HLA_A*0201限制性CTL表 位mInsB5_14的APL，其在HLA_A*0201背景下能显著下调天然表位mInsB5_14特异性CTL应答 水平；目的之二在于提供所述APL的获得方法，该方法同样适用于其它自身免疫疾病中自 身抗原的改造及其APL的筛选，可为治疗性负调疫苗的设计和研制提供有用的工具；目的 之三在于提供所述APL在医药方面的应用。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案1、胰岛素 B 链 HLA_A*0201 限制性 CTL 表位 APL，由 His-Leu-Cys-Gly-Pro-Phe-Le u-Val-Glu-Gla所示的氨基酸序列组成，是将鼠源胰岛素B链HLA_A*0201限制性CTL表位 mInsB5_14的第6位组氨酸替换为苯丙氨酸而得。2、所述胰岛素B链HLA-A*0201限制性CTL表位APL的获得方法，其特征在于包 括以下步骤a、利用计算机模拟技术建立胰岛素B链HLA-A*0201限制性CTL表位mInsB5_14与 HLA-A*0201分子的二元复合物结构模型，再进一步建立上述二元复合物与T细胞抗原受体 (TCR)的三元复合物结构模型，分析天然表位mInsB5_14*潜在的TCR主要作用位点；b、对步骤a所得天然表位mInsB5_14*潜在的TCR主要作用位点进行单氨基酸残基 突变，获得一系列天然表位mInsB5_14的候选APL，对这些候选APL进行计算机分析，从中筛 选出与HLA-A2分子亲和力高于天然表位、且空间构象和天然表位接近的候选APL ；c、合成步骤b筛选出的候选APL，通过细胞功能实验从中鉴定出在HLA_A*0201背 景下能够显著下调天然表位mInsB5_14特异性CTL应答水平的APL，即得本专利技术所述胰岛素 B链HLA-A*0201限制性CTL表位APL。3、所述胰岛素B链HLA-A*0201限制性CTL表位APL在制备I型糖尿病治疗性负 调肽疫苗中的应用。本专利技术的有益效果在于本专利技术提供了一种胰岛素B链HLA-A*0201限制性CTL表 位mInsB5_14的APL，其在HLA_A*0201背景下能显著下调天然表位mInsB5_14特异性CTL应答 水平，并具有易于规模化制备和纯化、使用安全等特点，可单独或联合其他免疫显性自身抗 原CTL表位APL应用于I型糖尿病治疗性负调肽疫苗的研制，在I型糖尿病治疗领域具有 较好的应用前景；本专利技术还提供了获得所述APL的方法，该方法同样适用于其它自身免疫疾病中自身抗原的改造及其APL的筛选，能够有效指导后续研究，减少肽合成与细胞功能 实验的工作量，降低研究成本，加快研究进度，从而为治疗性负调疫苗的设计和研制提供有 用的工具。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术作进 一步的详细描述，其中图1为TCR-HLA-A*020 l-mInsB5_14三元复合物的模拟结构，其中箭头a所指为TCR ； 箭头b所指为mInsB5_14 ；箭头c所指为HLA_A*0201分子；箭头d所指为mInsB5_14第6位点。图2为天然表位mInsB5_14和候本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王莉，舒驰，王书峰，陈晓玲，吴玉章，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学，
类型：发明
国别省市：85
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