【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种胞外分泌表达的透明质酸裂解酶及其重组菌与应用，属于生物。
技术介绍
1、透明质酸是一类糖胺聚糖，由重复的葡萄糖醛酸和n-乙酰氨基葡萄糖二糖单位组成，其具有的亲水性、粘弹性与生物相容性使其被广泛关注并应用于医药、美妆、食品等领域。透明质酸裂解酶(ha lyase)可通过β消除断裂其β-1，4糖苷键，降解为小分子透明质酸，在透明质酸加工、医药、发酵工业等领域应用广泛。
2、体内和体外实验证明，透明质酸的生物活性与其链长和分子量密切相关。低分子量透明质酸一般指相对分子质量在10-50kda之间的透明质酸，而相对分子质量小于10kda的透明质酸片段通常被归为透明质酸寡糖。与高分子量透明质酸不同，低分子量透明质酸与透明质酸寡糖具有独特的生物活性，如促进血管生成、抗氧化、抗炎等，因此在医药领域有着潜在的应用价值。此外，随着对透明质酸寡糖研究的深入，实验发现含不同二糖单元数量的透明质酸寡糖具有不同的生物学功能，如不饱和透明质酸二糖展现出独特的抗炎活性。因此，制备特定分子量的透明质酸有着重要意义。
3、目前，透明质酸的降解方法主要包括物理降解、化学降解和生物酶降解。其中，通过物理处理很难将透明质酸降解至10kda以下；化学方法能够制备透明质酸寡糖，但其弊端在于其需要苛刻的反应条件，并有可能引入不必要的副反应，如糖链中单糖残基结构的破坏。相比之下，酶降解透明质酸更环保，反应迅速且条件更温和。
4、微生物衍生透明质酸裂解酶的表达宿主几乎都是大肠杆菌，而在枯草芽孢杆菌杆菌中则很少见。在大肠杆菌系统
技术实现思路
1、为解决上述问题，本专利技术提供了一种可在枯草芽孢杆菌中高效表达的透明质酸裂解酶突变体，相对于改造前胞外酶活大幅提升，同时本专利技术基于该突变体构建了一株重组菌并开发了一种高效生产透明质酸裂解酶突变体的方法，为富含透明质酸的食品开发奠定了基础。
2、本专利技术的第一个目的是提供一种透明质酸裂解酶，所述透明质酸裂解酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。
3、本专利技术的第二个目的是提供编码所述透明质酸裂解酶的多核苷酸。
4、进一步地，所述多核苷酸的核苷酸序列如seq id no.2所示。
5、本专利技术的第三个目的是提供一种携带所述多核苷酸的表达载体。
6、进一步地，所述表达载体以质粒pp43nmk为载体。
7、本专利技术的第四个目的是提供一种表达所述透明质酸裂解酶的重组细胞。
8、进一步地，所述重组细胞的宿主可以为植物细胞、动物细胞、微生物(如细菌、真菌)等。
9、优选地，以枯草芽孢杆菌为宿主。
10、进一步地，以枯草芽孢杆菌为宿主构建重组菌时，采用信号肽调控所述透明质酸裂解酶的胞外分泌表达，所述信号肽选自npre信号肽(原有信号肽)、dacb信号肽、amye信号肽、nprb信号肽、bsna信号肽、phob信号肽、bpr信号肽、abna信号肽、apre信号肽、ywbn信号肽、wapa信号肽中的一种。
11、进一步地，所述枯草芽胞杆菌为枯草芽胞杆菌bacillus subtiliswb600。
12、本专利技术的第五个目的是提供一种生产透明质酸裂解酶的方法，采用所述重组菌进行发酵生产。
13、进一步地，所述发酵为分批发酵或补料分批发酵。
14、进一步地，所述分批发酵包括以下步骤：将所述重组菌接种至发酵培养基中，在发酵过程中，ph维持在5.5-8.0，转速维持在300-700rpm；
15、所述补料分批发酵包括以下步骤：将所述重组菌接种至发酵培养基中，在发酵过程中，ph维持在5.5-8.0，当溶氧开始上升时按8-12ml/h的速度加入补料培养基。
16、进一步地，所述发酵培养基中包括5-70g/l甘油，以豆饼水解物与酵母粉为氮源，氮源总浓度为40-100g/l，且其中豆饼水解物与酵母粉的质量比为1-4：1。
17、进一步地，所述发酵培养基中还包括10-30mm kh2po4以及50-100mm k2hpo4，ph为5.5-8.0。
18、进一步地，所述补料培养基包括甘油300-350g/l，豆饼水解物170-210g/l，酵母粉40-90g/l，60-110mm k2hpo4，340-380mm kh2po4。
19、进一步地，发酵温度为25-37℃，ph5.5-8.0。
20、本专利技术的第六个目的是提供所述透明质酸裂解酶、多核苷酸、表达载体或重组细胞在降解透明质酸中的应用。
21、进一步地，所述应用是将高分子量透明质酸降解为低分子量透明质酸或寡糖。
22、进一步地，所述透明质酸为高分子量透明质酸，分子量为1000～1500kda。
23、进一步地，降解透明质酸的条件为：反应温度35-45℃、反应ph 5.5-8、搅拌速度200-240rpm、透明质酸浓度0.5-2g/l。
24、本专利技术的有益效果：
25、本专利技术以来源于链球菌噬菌体的透明质酸裂解酶为出发序列进行改造，随后克隆其编码基因并在枯草芽孢杆菌体系实现了重组表达，经过信号肽替换后胞外酶活为1.86×104u/ml，蛋白分子量为39.5kda。酶学性质表征实验表明其为内切酶，能够在ph 5-8范围内发挥透明质酸降解作用，最适反应ph为6.0，最适反应温度为40℃，金属离子对其有促进作用，该酶具有良好的热稳定性，ph稳定性。探究了基于产透明质酸裂解酶重组菌的发酵与罐上放大工艺，利用优化的培养基，在20-l发酵罐中，重组菌产透明质酸裂解酶的最高胞外活性在40h可达1.07×105u/ml。
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1.一种透明质酸裂解酶，其特征在于，所述透明质酸裂解酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.编码权利要求1所述透明质酸裂解酶的多核苷酸。
3.携带权利要求2所述多核苷酸的表达载体。
4.表达权利要求1所述透明质酸裂解酶的重组细胞。
5.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌异源表达了权利要求1所述的透明质酸裂解酶。
6.根据权利要求5所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，采用信号肽调控所述透明质酸裂解酶的胞外分泌表达，所述信号肽选自nprE信号肽、dacB信号肽、amyE信号肽、nprB信号肽、bsnA信号肽、phoB信号肽、bpr信号肽、abnA信号肽、apre信号肽、ywbN信号肽、wapa信号肽中的一种。
7.一种生产透明质酸裂解酶的方法，其特征在于，采用权利要求5或6所述的重组枯草芽孢杆菌进行发酵生产。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵为分批发酵或补料分批发酵，
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括：5-70g/L
10.权利要求1所述透明质酸裂解酶、权利要求2所述多核苷酸、权利要求3所述表达载体、权利要求4所述重组细胞或权利要求5或6所述重组枯草芽孢杆菌在降解透明质酸中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种透明质酸裂解酶，其特征在于，所述透明质酸裂解酶的氨基酸序列如seq idno.1所示。
2.编码权利要求1所述透明质酸裂解酶的多核苷酸。
3.携带权利要求2所述多核苷酸的表达载体。
4.表达权利要求1所述透明质酸裂解酶的重组细胞。
5.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌异源表达了权利要求1所述的透明质酸裂解酶。
6.根据权利要求5所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，采用信号肽调控所述透明质酸裂解酶的胞外分泌表达，所述信号肽选自npre信号肽、dacb信号肽、amye信号肽、nprb信号肽、bsna信号肽、phob信号肽、bpr信号肽、abna信号肽、...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱律，龚劲松，李恒，陆震鸣，江佳宇，郑德强，刘磊，康传利，张美霞，史劲松，许正宏，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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