一种基因工程技术领域的制备基因工程菌株的方法及生产藤黄绿菌素的方法；制备所述菌株的方法包括如下步骤：从假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ?ｓｐ．）Ｍ１８的总基因组ＤＮＡ中克隆ｐｑｓＲ基因；将ｐｑｓＲ基因亚克隆至携带抗生素抗性基因的质粒，得重组质粒；在ｐｑｓＲ基因中插入抗生素抗性基因，构建重组自杀质粒；将重组自杀质粒转化至大肠杆菌，之后与假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ?ｓｐ．）Ｍ１８野生型菌株双亲杂交，抗性筛选，即得基因工程菌株；利用前述基因工程菌株生产藤黄绿菌素的方法，包括如下步骤：培养基因工程菌株，得发酵液；提纯发酵液，得藤黄绿菌素。利用本发明专利技术制备的基因工程菌株使得藤黄绿菌素的发酵效价约为１５０毫克，与现有技术相比发酵效价提高了３～４倍。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基因工程
的菌株及利用该菌株生产抗生素的方法，具体 是一种。
技术介绍
假单胞菌(Pseudomonas sp. )M18是从上海郊区甜瓜根际分离筛选到的一株重要 的植物根际促生假单胞菌株，它能分泌一种聚酮类抗生素-藤黄绿菌素(Huang XQ, etal. Identification and characterization of pltZ, a gene involved in therepression of pyoluteorin biosynthesis in Pseudomonas sp. M18. FemsMicrobiology Letters 2004,232:197 202)。藤黄绿菌素由一个间苯二酚环(起源于聚酮生物合成)和一个氯 化的吡咯环的部分结构共同组成，具有广谱活性，能抑制细菌和真菌，特别是抑制卵菌属真 菌如终极腐霉等，可用于除草(Haas D, Defago G, Biological control of soi 1-borne pathogens by fluorescent pseudomonads. NatureReviews Microbiology 2005,3:307 319)。离体培养皿生物测定显示，藤黄绿菌素对各种农作物真菌性病原菌特别是对水稻纹 枯病菌、腐霉和疫霉等具有高效的广谱抑菌作用。藤黄绿菌素在自然界中易降解、无残留， 是一种高效、安全、低毒、低残留、环保型的微生物源农药。假单胞菌(Pseudomonas sp.)M18 野生型分泌的藤黄绿菌素浓度非常低，不适合规模化的工业生产。为了进一步提高藤黄绿 菌素产量、降低生产成本，实现藤黄绿菌素的产业化，迫切需要大幅度提高藤黄绿菌素的发 酵效价。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种制备基因工程菌株的方法及生 产藤黄绿菌素的方法。利用本专利技术制备的PqsR基因阻断工程菌M18PRG，每升发酵液中，藤 黄绿菌素的发酵效价约为150毫克，与现有技术相比发酵效价提高了 3 4倍，该工程菌可 为进一步构建多基因高产工程菌株应用于微生物源农药生产奠定基础。本专利技术是通过以下的技术方案实现的，第一方面，本专利技术涉及一种基因工程菌株的制备方法，包括如下步骤步骤一，从假单胞菌(Pseudomonas sp. )M18的总基因组DNA中克隆pqsR基因；步骤二，将pqsR基因亚克隆至携带抗生素抗性基因的质粒，得重组质粒；步骤三，在pqsR基因中插入抗生素抗性基因，构建重组自杀质粒；步骤四，将重组自杀质粒转化至大肠杆菌，之后与假单胞菌(Pseudomonas sp.) M18野生型菌株双亲杂交；步骤五，利用含有步骤三所述抗生素的培养基和含有步骤二所述抗生素的培养基 进行筛选，得到能在含步骤三所述抗生素的培养基上生长，且在含步骤二所述抗生素的培 养基上不能生长的菌株，即得基因工程菌株。步骤二中，所述质粒为pEX18Tc、pEX18Gm或pEX18Ap。3优选地，所述质粒为pEX18Tc。步骤二中，所述抗生素抗性基因为四环素抗性基因、庆大霉素抗性基因或氨苄青 霉素抗性基因。优选地，所述抗生素抗性基因为庆大霉素抗性基因。步骤三中，所述抗生素抗性基因为庆大霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因。步骤四中，所述大肠杆菌为大肠杆菌SM10。步骤五中，所述培养基为LB培养基。第二方面，本专利技术还涉及利用前述基因工程菌株生产藤黄绿菌素的方法，包括如 下步骤步骤一，培养基因工程菌株，得发酵液；步骤二，提纯发酵液，得藤黄绿菌素。步骤一中，所述培养使用的培养基具体为该培养基的pH为7. 5，1L培养基的组分 为蛋白胨 20g，甘油 15mL，MgSO4 1. 5g，K2HPO4O. 3g，余量为水。与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果本专利技术克隆了假单胞菌 (Pseudomonas sp. )M18中强烈抑制藤黄绿菌素生物合成的负调控基因pqsR、阻断了 pqsR 基因的功能，构建了基因工程菌M18PRG，利用本专利技术制备的pqsR基因阻断工程菌M18PRG， 每升发酵液中，藤黄绿菌素的发酵效价约为150毫克，与现有技术相比发酵效价提高了 3 4倍，该工程菌可为进一步构建多基因高产工程菌株应用于微生物源农药生产奠定基础。本专利技术涉及的假单胞菌(Pseudomona sp. )M18菌株已在专利号为ZL 00119857. 2 的中国专利技术专利中公开。附图说明图1为用于pqsR基因双交换的重组自杀质粒构建示意图；图2为pqsR基因阻断工程菌M18PRG与假单胞菌(Pseudomonas sp. )M18野生型 菌株的藤黄绿菌素产量的HPLC定量测定图。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术 而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件，例如 Sambrook 等分子克隆实验室手册(New York Co Id Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例pqsR基因阻断工程菌M18PRG的构建及发酵生产藤黄绿菌素步骤一，pqsR基因的克隆(1)根据LysR家族调控蛋白PqsR编码基因保守序列设计引物，利用PCR技术从假 单胞菌M18基因组模板中扩增包含pqsR基因的DNA片段。引物 1:5' -TAT AGA ATT CAC ATG CCG GCA TGC CAG-3‘，带下划线的碱基为 EcoRI酶切位点；引物 2:5' -TAA TAA GCT TTG GCC GAT GCC GAT GGC-3‘，带下划线的碱基为HindIII酶切位点。PCR反应体系(50 μ L) 10 X高保真DNA聚合酶缓冲液5 μ L，dNTP (2. 5mmol/ L) 4 μ L，引物1和引物2各1 μ L，模板DNA 3 μ L，高保真酶(5U/ μ L) 0. 2 μ L，重蒸水 35. 8 μ L0 PCR 反应条件94°C 5min ;30 个循环，每个循环具体为94°C 40s，65°C 1. 5min, 72°C 90s ；之后72°C IOmin0染色体DNA提取采用UNIQ-10柱式基因组DNA抽提试剂盒(上 海生工生物工程技术服务有限公司)。(2)回收1. 5-kb的包含pqsR基因的PCR产物，委托英骏生物技术有限公司进行 DNA测序，分析发现，所测序列中包含一个999-bp的开放阅读框(SEQID NO :1)，编码一个大 小为332个氨基酸的细菌LysR家族调控蛋白(SEQID NO :2)。(3)包含pqsR基因的PCR产物经EcoR I和HindIII双酶切后，克隆经 EcoR I 和 HindIII 双酶切处理的 pEX18Tc 质粒(Hoang TT, Karkhoff-Schweizer RR, et al.Abroad-host-range Flp-FRT recombination system for site-specific excision ofchromosomally-located DNA sequence本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基因工程菌株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 步骤一，从假单胞菌Ｍ１８的总基因组ＤＮＡ中克隆ｐｑｓＲ基因； 步骤二，将ｐｑｓＲ基因亚克隆至携带抗生素抗性基因的质粒，得重组质粒； 步骤三，在ｐｑｓＲ基因中插入抗生素抗性基因，构建重组自杀质粒； 步骤四，将重组自杀质粒转化至大肠杆菌，之后与假单胞菌Ｍ１８野生型菌株双亲杂交； 步骤五，利用含有步骤三所述抗生素的培养基和含有步骤二所述抗生素的培养基进行筛选，得到能在含步骤三所述抗生素的培养基上生长，且在含步骤二所述抗生素的培养基上不能生长的菌株，即得基因工程菌株。
【技术特征摘要】
CN 2010-3-3 201010116085.1一种基因工程菌株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤步骤一，从假单胞菌M18的总基因组DNA中克隆pqsR基因；步骤二，将pqsR基因亚克隆至携带抗生素抗性基因的质粒，得重组质粒；步骤三，在pqsR基因中插入抗生素抗性基因，构建重组自杀质粒；步骤四，将重组自杀质粒转化至大肠杆菌，之后与假单胞菌M18野生型菌株双亲杂交；步骤五，利用含有步骤三所述抗生素的培养基和含有步骤二所述抗生素的培养基进行筛选，得到能在含步骤三所述抗生素的培养基上生长，且在含步骤二所述抗生素的培养基上不能生长的菌株，即得基因工程菌株。2.根据权利要求1所述的基因工程菌株的制备方法，其特征是，步骤二中，所述质粒为 pEX18Tc、pEX18Gm 或 pEX18Ap。3.根据权利要求2所述的基因工程菌株的制备方法，其特征是，所述质粒为pEXISTc。4.根据权利要求1所述的基因工程菌株的制备方法，其特征是，...
【专利技术属性】
技术研发人员：许煜泉，黄显清，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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