一种肝脏靶向性的基因工程干扰素及其制备方法技术

本发明专利技术属于生物制药领域。本方面提供了具有更高肝脏靶向性的基因工程干扰素，所述基因工程干扰素具有Ｎ－糖基化修饰，糖链末端具有半乳糖分子，在动物和人体内具有明显的肝靶向性，使所述基因工程干扰素更有利于病毒性肝炎的治疗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物制药领域。本专利技术涉及一种基因工程干扰素。具体而言，本专利技术涉及经半乳糖基修饰的基因工程干扰素及其制备方法，该基因工程干扰素具有明确的靶向肝脏的特性。专利技术背景干扰素(Interferon，IFN)是临床用于治疗病毒性肝炎的常用药物。普通干扰素在体内半衰期短，需反复多次给药，导致患者生理及经济负担加重，并且容易引发副反应，限制了其临床应用。对于IFN这类具有生理或药理活性的生物活性蛋白，通常采用缓释、化学修饰和基因工程改造等手段来改善其生物活性。例如罗氏和先灵葆雅的PEG化干扰素、白蛋白融合干扰素均具有较长的半衰期；美国专利US4695623和US4897471设计的复合干扰素，可使用3-5倍于普通干扰素的剂量而副反应没有增加。然而，无论是普通干扰素还是长效干扰素，其在肝脏的分布均不到给全部给药剂量的10％，不得不依靠加大给药剂量来弥补肝靶向性较差的不足。提高干扰素向肝脏的运输，减少干扰素与其它器官的结合，对于增强其治疗效果、减少副反应将具有很大的益处。利用肝脏中特异的去唾液酸糖蛋白受体识别药物中的半乳糖组分，来提高药物肝靶向性的研究已有报导。中国专利申请CN1087093A就采用半乳糖化学修饰的方法来提高干扰素的肝靶向性；申请号为200810021401.X的中国申请中则采用向干扰素融合的白蛋白上加入半乳糖的方式，来提高其肝靶向性。但是，这些改造方式均属于人工分子改造，改造后蛋白分子与天然分子的差异较大，因此可能会引发人体较强的免疫反应，不仅影响其治疗活性，而且往往会带来很强的副反应。众所周知，天然干扰素多属于糖蛋白。因此如果能够通过基因工程方法，改变干扰素分子中糖基化修饰糖链类型或结构从而改变干扰素的靶向特性，则能够最大限度减少免疫原性的引入。并且通过基因工程方法获得的糖基修饰工程化干扰素还具有分子高度均一的特点，这对于生物技术药物的成药性而言至关重要。本专利技术人通过大量研究，借助基因工程手段，实现在干扰素修饰糖链的末端引入特定的糖基，使改造后的干扰素与肝脏上相应受体具有更高的结合能力，从而实现提高其肝靶向性的目的。
技术实现思路
本方面旨在提供一种肝靶向性的基因工程干扰素。本专利技术基于以下设计原理：天然IFN-β含有166个氨基酸，在Asn80处存在一个N-糖基化位点(Asn-Glu-Thr)，因此在Thr上连有N-修饰糖链；同理，将IFN-α1分子中位于Asn34下游的Arg36突变为Ser，则可在突变后的Ser上引入一个N-糖基化修饰糖链。在此基础上，通过改变干扰素分子中糖基化修饰糖链类型或结构来改变干扰素的靶向分布特性，利用糖基工程化的毕赤酵母作为表达宿主菌，实现在干扰素修饰糖链的末端引入特-->定糖基如半乳糖分子，使其具有GalGlcNAcMan5GlcNAc2或Gal2GlcNAcMan5GlcNAc2的结构，改造后的干扰素与肝脏非唾液酸受体具有更高的结合能力，从而实现提高其肝靶向性的目的。一方面，本专利技术提供了一种半乳糖基化基因工程干扰素，所述干扰素用基因工程方法生产，为具有N-糖基化修饰的糖蛋白，修饰糖链末端为半乳糖残基。所述基因工程干扰素中的N-糖基化位点可以是天然存在的，或者通过突变引入。在本专利技术的一个技术方案中，其中所述的干扰素为干扰素β，其氨基酸由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列编码。其中所述修饰糖链具有GalGlcNAcMan5GlcNAc2或Gal2GlcNAcMan5GlcNAc2的结构特征。另一方面，本专利技术提供了一种制备所述基因工程干扰素的方法，该方法包括：a)根据毕赤酵母密码子偏嗜性设计并合成编码所述干扰素蛋白分子的cDNA；b)将所述cDNA克隆至表达载体，并导入毕赤酵母中构建表达工程菌；c)诱导所述工程菌表达重组干扰素；d)从培养液中纯化重组干扰素。在本专利技术的一个实施方案中，其中所述的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本专利技术的优点在于：1.本专利技术提供的基因工程干扰素在性能和生产方式上均区别于传统的干扰素，在靶向性和安全性上比传统干扰素更具优势。2.另一方面，这种通过基因工程方法获得的糖基修饰工程化干扰素还具有分子高度均一的特点，这对于生物技术药物的成药性而言至关重要。附图说明图1图示的是重组半乳糖基化IFN-β的糖链分析测定结果。图2图示的是半乳糖修饰基因工程干扰素β的组织分布情况，其中图2a图示的是糖链修饰结构为GalGlcNAcMan5GlcNAc2的重组干扰素β组织分布图；图2b图示的是未经糖基化修饰的重组干扰素β组织分布图。其中总放代表总放射性，酸沉代表沉淀的干扰素蛋白分子的放射性。下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。本领域技术人员应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而绝不对本专利技术的范围构成任何限制。除另有说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本专利技术所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。本申请中引用的任一专利、专利申请和出版物在此引入作为参考。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常采用常规条件，或按照制造厂商所建议的方法。实施例实施例1肝靶向性基因工程干扰素β的制备1.1重组IFN-β表达质粒的构建1.1.1IFN-β编码基因的优化与合成-->IFN-β采用Genebank公开的氨基酸序列(NP_002167)，其糖蛋白分子在Asn80处含有一个N-糖基化位点(参见J.Biol.Chem.262(30)，14600-14605(1987))。根据毕赤酵母密码子偏嗜性，使用DNAWORK3.1设计优化的IFN-β的编码cDNA序列，如SEQ ID NO：1所示。在SEQ ID NO：1所示cDNA序列的上、下游引入XhoI和XbaI酶切位点，然后克隆于pUC19载体中，命名为pUC19-IFN质粒。所述序列由上海生工生物工程有限公司合成。1.1.2目的片段和鉴定用XhoⅠ/Xba I双酶切上述pUC19-IFN质粒，于长波紫外光下切下500bp条带，放在1.5mLEppendorf管中；加入3倍体积的溶胶液，室温放置5min，其间轻摇几次，使胶完全溶化；加入10μL玻璃奶，颠倒混匀，冰浴放置10min，间隔2-3min混匀一次；加入250μL漂洗液，将玻璃奶混匀，12000rpm离心30s，吸弃上清；再重复洗涤一次，离心后将漂洗液吸干净，放入37℃温箱干燥15-20min；最后加入适量的蒸馏水，混匀，60℃水浴5min，12000rpm离心1min，洗脱上清鉴定后备用。1.1.3载体与目的片段连接以XhoⅠ/Xba I双酶切pPICZαA(Invitrogen，USA)载体，酶切产物直接采用玻璃奶回收，回收产物经电泳鉴定，大小为3600bp。取载体1μl，1.2中回收的目的片段7μl，10xT4 ligase buffer与T4 DNA ligase各1μl进行连接反应，16℃过夜.1.1.4转化大肠杆菌感受态细胞Top10取5ul过夜连接产物加入100ul感受态细胞中，轻轻旋几次以混匀内容物，在冰上放置30min，再转入42℃循环水浴中，放置90s，不要摇动EP管.将EP管转移到冰浴中，使细胞冷却1-2min，加入500ulLLB培养基，37℃温育45min，将200ul感受态细胞加入到含25ug/m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种半乳糖基化基因工程干扰素，其特征在于用基因工程方法生产，为具有Ｎ－糖基化修饰的糖蛋白，修饰糖链的末端为半乳糖残基。

【技术特征摘要】
1.一种半乳糖基化基因工程干扰素，其特征在于用基因工程方法生产，为具有N-糖基化修饰的糖蛋白，修饰糖链的末端为半乳糖残基。2.权利要求1所述的半乳糖基化基因工程干扰素，所述干扰素具有优于普通干扰素的肝靶向性。3.权利要求1或2所述的半乳糖化基因工程干扰素，其中所述的N-糖基化的位点是天然存在的。4.权利要求1或2所述的半乳糖化基因工程干扰素，其中所述的N-糖基化的位点是通过突变引入的。5.权利要求1-4中任一项所述的半乳糖化基因工程干扰素，其中所述干扰素具有如SEQID NO：1所示核苷酸序列编码的氨基酸序列。6.权利要求1-5中任一项所述的半乳糖化基因工程干扰素，其中所述修饰糖链末端...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋海峰，高新，王清清，董立厚，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]