乙型肝炎核酸疫苗及其构建方法技术

本发明专利技术涉及生物医药技术领域，目前有报道的乙肝病毒疫苗主要包含ＨＢｓＡｇ、ｐｒｅＳ１、ｐｒｅＳ２和ＨＢｃＡｇ任意一种或者几种基因，再加上一些具有免疫增强作用的细胞因子基因，或者淋巴细胞表位基因等，但是其免疫预防效果和治疗效果一直不尽人意。本发明专利技术提供一种乙肝疫苗包括乙型肝炎病毒表面抗原基因ＨＢｓＡｇ、核心蛋白基因ＨＢｃ以及ｅ抗原基因，还含有人ｍｉｃｒｏＲＮＡ１８１ａ前体基因序列，可以辅助刺激机体免疫通路。本疫苗的构建过程涉及ＰＣＲ、酶切、连接、转化等分子生物学操作手段。本疫苗能够有效激活机体产生针对乙型肝炎病毒的特异性抗体，并能够刺激机体细胞免疫，分泌多种细胞因子，从而达到治疗慢性乙型肝炎的目的。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种新的抗HBV病毒的DNA疫苗及其构建方法。
技术介绍
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一种世界性的传染病。我国是HBV感染 高发区，约有7-8亿人感染过乙型肝炎，约1.2亿人为乙肝病毒携带者，他们中的1/4发展 为慢性肝炎、肝硬化或原发性肝癌。自1985年我过开始接种乙肝疫苗以来，在免疫儿童中 乙肝病毒携带者已由10%降至左右。因此实践证明，乙肝疫苗是预防和控制乙型肝炎 最有效的武器。乙型肝炎病毒为嗜肝DNA病毒，具有双层壳结构，外壳由乙型肝炎病毒表面抗 原(HBsAg)、前Sl蛋白(preSl)、前S2蛋白(preS2)构成；内壳由乙型肝炎病毒核心抗原 (HBcAg)和e抗原(HBeAg)构成；内壳内有双链环状DNA和DNA聚合酶。目前有报道的乙肝病毒疫苗主要包含HBsAg、preSl、preS2和HBcAg任意一种或者 几种基因，再加上一些具有免疫增强作用的细胞因子基因，或者淋巴细胞表位基因等(Qing Y, et al. Construction of an HBV DNA vaccine byfusion of the GM-CSF gene to the HBV-S gene and examination of its immuneeffects in normal and HBV-transgenic mice. Vaccine. 2010Junll ；28 (26) :4301_7.)。但是其免疫预防效果和治疗效果一直不尽 人意，尤其是对慢性HBV感染者来说，由于体内长期存在相应抗原，机体免疫系统对于HBV 抗原已经形成免疫耐受状态，因此其接种该疫苗后，免疫反应性远远低于正常人。因此乙肝 DNA疫苗对于慢性乙肝患者的免疫耐受和激活HBV特异性T细胞免疫的效果不是很理想。microRNA作为近年来生物学研究的热门分子受到广泛的关注。microRNA参与了 生物体众多转录后调控过程，在细胞增殖分化、抗肿瘤与免疫等领域发挥重要作用。有研究 表明，microRNA参与了人体许多免疫通路的调控，细胞免疫与体液免疫等领域都发挥重要 作用。miRNA-lSla能够调节B细胞分化，并能够调节CD4+T细胞活化与敏感性，因此可以 作为天然的疫苗佐剂力口 以利用(Mark A. Lindsay. microRNAs and the immune response. Trends inlmmunology, Volume 29,Issue 7,343-351)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能够同时激活机体体液免疫与细胞免疫，免疫效果 强，免疫作用持久，构建工艺简便的抗HBV病毒DNA疫苗。如
技术介绍
所述，现有的乙肝核酸疫苗存在诸多缺陷，因此如果能够在传统核酸 疫苗后直接连接疫苗佐剂便可提高其免疫效果。基于以上理论，本专利技术人用分子生物学技 术手段，将HBV病毒的表面抗原、核心抗原与e抗原基因克隆入真核表达载体，并在其后加 入miRNAlSla前体片段作为增强免疫效果的疫苗佐剂，从而构建一种既含有抗原蛋白基因 又含有疫苗佐剂的新型乙肝DNA疫苗。本专利技术提供了一种乙型肝炎核酸疫苗，以真核表达载体为基本骨架，含有乙肝病 毒HBV包膜蛋白基因HBsAg、乙肝病毒核心抗原HBc与e抗原基因；还含有人的pre-miR181a 序列，其中乙肝病毒HBV包膜蛋白基因HBsAg的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示、乙肝病毒 核心抗原HBc与e抗原基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示；人的pre_miR181a序列如 SEQ ID NO 5 所示。所述的真核表达载体为Invitrogen公司的真核表达质粒pcDNA 3. l/V5_His B。本专利技术还提供了上述乙肝核酸疫苗的构建方法，包含以下步骤A、乙型肝炎病毒HBV包膜抗原、乙肝病毒核心抗原HBc与e抗原基因以及人 miR181a前体基因克隆(I)以HBV全基因组为模板，设计引物，通过PCR反应扩增得到HBV SDNA片段，引 物序列如下S-F :ATGGAGAGCACAACATCAGGS-F TCAAATGTATACCCAAAGACAAAAGA(II)以HBV全基因组为模板，设计引物，通过PCR反应扩增得到HBV C抗原与e抗 原的DNA序列，引物序列如下C-F :ATGGACATTGACCCGTATAAC-F CTAACATTGAGATTCCCGAGAT(III)以THP-I细胞基因组为模板，设计引物，通过PCR反应扩增得到miR181a前 体，引物序列如下181F TCGACTTGAAACCCAGAGAGG18IR :AATTCACTGGACCACATTTGGB、将上述乙型肝炎病毒HBV包膜抗原、乙肝病毒核心抗原HBc与e抗原基因以及 人miR181a前体基因插入同一真核表达载体pcDNA 3. l/V5_His B。本专利技术还提供了上述乙肝核酸疫苗在用于制备治疗乙型肝炎药物中的应用。本专利技术的乙肝核酸疫苗具有以下优点第一，本疫苗通过真核表达质粒介导注射 方式接种，安全可靠；第二，本疫苗能够同时作用机体体液免疫与细胞免疫，免疫效果较好； 第三，由于本疫苗克隆表达HBV病毒完整的表面抗原、核心抗原与e抗原，所以其免疫效果 与对机体的保护力明显高于多表位疫苗；第四，本疫苗以真核表达质粒为载体，能够在体内 长期表达，免疫效果持久；第五，本疫苗自身已包括microRNA佐剂，不需额外添加，简化制 作工艺。附图说明图1为本核酸疫苗pcDNA3. l_S-C_181a结构示意2为HBV S抗原真核表达载体制备流程3为HBV核心抗原与e抗原真核表达载体制备流程4为pre-miR181a表达载体制备流程5为ELISP0T法测定在HBsAg与HBc刺激后本核酸疫苗对于小鼠脾脏细胞免疫 激活情况，其中图5a纵坐标表示每IO6脾脏中产生INF-γ的细胞数目，横坐标表示组别； 图5b纵坐标表示每IO6脾脏中产生IL-4的细胞数目，横坐标表示组别。具体实施例方式下面结合附图和实施例对本专利技术作详细描述，但本专利技术的实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本专利技术的保护范围。实施例1 本专利技术核酸疫苗的构建本专利技术所采用PCR、酶切、连接、转化等分子生物学实验方法构建DNA疫苗，可 以参考美国萨姆布鲁克著《分子克隆》第二版。PCR引物设计软件为Premier Biosoft International ^w] ^ Primer PREMER V。构建本疫苗的基本材料包括人单核细胞THP-I (购自中国科学院细胞库)、稳定 转染HBV全病毒的H印G 2. 215肝癌细胞(购自中国科学院武汉病毒所)；真核表达载体 pcDNA 3. 1/V5-His B 质粒(购自 Invitrogen 公司)。构建本核算病毒所需试剂包括Prime Star高保真DNA聚合酶(购自TaKaRa公 司)、pMD18T克隆载体(购自TaKaRa公司)、各种限制性内切酶(购自NEB公司)、T4连接 酶(购自TaKaRa公司)、反转录试剂M-MLV (购自Invitrogen公司)、RNA抽提Trizol试 剂(购自Invitrogen公司)。构建本疫苗的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乙型肝炎核酸疫苗，以真核表达载体为基本骨架，其特征在于该疫苗含有乙肝病毒ＨＢＶ包膜蛋白基因ＨＢｓＡｇ、乙肝病毒核心抗原ＨＢｃ与ｅ抗原基因；还含有人的ｐｒｅ－ｍｉＲ１８１ａ序列，其中乙肝病毒ＨＢＶ包膜蛋白基因ＨＢｓＡｇ的核苷酸序列如ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：１所示、乙肝病毒核心抗原ＨＢｃ与ｅ抗原基因的核苷酸序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２所示；人的ｐｒｅ－ｍｉＲ１８１ａ序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４所示。

【技术特征摘要】
一种乙型肝炎核酸疫苗，以真核表达载体为基本骨架，其特征在于该疫苗含有乙肝病毒HBV包膜蛋白基因HBsAg、乙肝病毒核心抗原HBc与e抗原基因；还含有人的pre miR181a序列，其中乙肝病毒HBV包膜蛋白基因HBsAg的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示、乙肝病毒核心抗原HBc与e抗原基因的核苷酸序列如SEQ ID NO2所示；人的pre miR181a序列如SEQ ID NO4所示。2.根据权利要求1所述的一种乙型肝炎核酸疫苗，其特征在于其中所述的真核表达载 体为 pcDNA 3. 1/V5-His B 质粒。3.—种如权利要求1或2所述的乙肝核酸疫苗的构建方法，包含以下步骤A、乙型肝炎病毒HBV包膜抗原、乙肝病毒核心抗原HBc与e抗原基因以及人miR181a 前体基因克隆(I)以HBV全基因组为模板，设计引物，通过PCR反应扩增得到HBVSDNA片段，引...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙树汉，魏伟，章意亮，商京丽，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]