乙型肝炎治疗性疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种新型乙型肝炎治疗性疫苗以及制备该疫苗的方法。所述疫苗是以质粒脱氧核糖核酸（ＤＮＡ）为基础，用含有乙型肝炎病毒表面抗原多肽（ｐｒｅＳ多肽及完整的ＨＢＳＡｇ）基因转录及蛋白合成的ＤＮＡ连接入质粒载体构成。该疫苗既能用于乙肝预防，又可用于慢性乙肝病人的治疗。是一种安全、经济、有效的治疗性疫苗。所提供的制备方法工艺简单，成本较低，生产出的疫苗质量高，适于大量生产。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种新型，确切地是涉及一种以质粒脱氧核糖核酸(DNA)为基础的。乙型肝炎病毒(简称乙肝病毒)感染是传播最为广泛的一种人类病毒感染。全世界约有三亿慢性感染病人，并且据估计每年还有约两千万新病例(Davis,H.L,Michel,M-L&Whalen,R.G.1993,Hum、Mol.Genet.2:1847-1851)。绝大多数乙肝病毒感染发生在亚洲和非洲国家。在东南亚某些地区，乙肝病毒携带者高达总人口百分之十到二十(Gust,I.D.1982,in Viral Hepatitis,eds.Szmuness,W.,Alter,H.J.andMaynard,J.E.(Franklin Institute Press,Philadelphia),P 129；Davis,1993)。乙肝病毒感染是急性肝炎发病主要病原之一。乙型肝炎的特征是肝细胞损伤及炎症反应(Redecker,A.G.1975,Am.J.Med.Sci.270:9-16)。原发性乙肝病毒感染通常是自限性的，病毒抗原随之清除，大约有百分之十的病人产生持续性感染(Ganem,D.1982,Rev.Infect.Dis.4:1026-47)。持续性即慢性乙肝病毒感染可导致肝硬化，终至肝功能衰竭及其他严重后果。流行病学调查显示，慢性乙肝病毒感染与原发性肝细胞肝癌有紧密的相关性(Blumberg,B.S.et.al.,1971,in Australian AntigenandHepatitis(CRC,Cleveland,OH)；Beasley,R.P.et、al.,1981,Lancet 2:1129-1133)。慢性乙肝病毒携带者的原发性肝细胞肝癌发病率是非携带者的一百多倍(Beasley,1981)。在东南亚及非洲的一些乙肝高发地区，原发性肝细胞肝癌是首位致死病因。例如，原发性肝细胞肝癌致死率是台湾地区全部癌症致死率的百分之二十(Chen,D-S,1987,inOkada,K.&Ishak,K.eds.Neoplasms of Liver,(Springer Verlag,Berlin))。乙肝病毒感染的主要后果中，肝硬化及原发性肝细胞肝癌危害最大。尽管世界各国为寻求有效的预防和治疗乙型肝炎病毒感染已经投入了巨大的人力和物力，但迄今仍没有一项理想的治疗方案可以治愈乙肝病毒感染的病人。因此，为使人们免除感染乙肝病毒的痛苦，开发经济而有效的乙肝治疗性疫苗，是一项世界性的重大而迫切的任务，这一任务对于亚非发展中国家显得更为重要。目前，在美国已知有两类乙肝疫苗已进入临床应用，这两种疫苗均含有乙肝表面抗原(不含乙肝的其他抗原或核心抗原)。其中之一是由慢性乙肝病毒携带者的血浆中提取的，经福尔马林灭活的HBsAg(Maupas,P.,Goudeau,A.,Coursaget,P.&Drucker.J.1976,Lancet 1:1367-1370)。这种疫苗经使用，证明基本上是安全有效的。另一种是从酵母菌中表达提纯的重组乙肝表面抗原(Valenzuela,P.et.al.,1982,Nature(London)298:347-82)，与前一种有相似的安全有效性。这两种疫苗在健康人群中的保护率可达百分之九十，但在免疫抑制病人(如肾透析、器官移植病人等)中只达到约百分之五十的保护率(Pead,P.J、et.al.,1985,Lancet1:1152；Wiederman,G.et.al.,1987,Vaccine 5:179-84)。更为重要的是上述这两种疫苗均为蛋白质，需从血浆或重组酵母菌中纯化。由于纯化蛋白质的过程复杂，而且原料有限，生产成本过于昂贵，加上蛋白质生物制品需冷冻保存，生物活性限期较短，这样就大大限制了这些乙肝疫苗在发展中国家的广泛使用。近年来，由于血浆制品不仅来源有限，而且此疫苗有带感染性病毒颗粒污染的可能性，约万分之一的受接种人因此受害，从而得到乙肝病毒感染并成为新的感染源。同时人们对其他可能的病原体污染(如艾滋病毒或其他尚未明确的新病原体)的关注也日益增加，因此，人们已在探索生产乙肝疫苗的其他途径。大肠杆菌、酵母菌、哺乳类细胞均已被试用来表达乙肝病毒抗原，以期生产无感染性的新的亚单位疫苗。但是迄今为止，乙肝病毒表面抗原无法在大肠杆菌而只能在真核细胞中有效地表达(Dubois,M.F.et,al,1980,Proc,natl.AcadSci.USA 77:209-217；Moriarty,A.M.et.al.,1981,Proc,natl.Acad.Sci.USA78:2606-71；Wang,Y.et.al.,1982,The EMBO Journal 1:1213；Gough,N.&Murray,K.1983,J、Mol.Biol.162:43-48)。哺乳动物细胞也可以用来表达乙肝表面抗原，但有可能带有病毒、活化的癌基因及其他活化因子或人类尚未认识到的病原体。而酵母菌表达的乙肝表面抗原的纯化过程需要裂解细胞，因而，这种疫苗生产的成本较高。疫苗生产成本高及贮藏不方便是现有乙肝疫苗无法在发病率较高的发展中国家得到广泛应用的主要原因。此外，上述两种现有的乙肝疫苗均需多次注射才能达到免疫效果，同时这两种疫苗对慢性病毒携带者没有治疗效果。从而，本专利技术的目的是为了克服上述现有疫苗所存在的缺点，提供一种安全可靠、性能稳定、制备简便、易于贮存和便于应用的新型乙肝治疗性疫苗。此外，本专利技术的另一目的是为了制备上述新型治疗性疫苗而提供一种制备该疫苗的方法，该方法生产成本低、工艺简单、生产出的疫苗质量高。本申请的专利技术人根据过去十五年左右分子生物学的发展，对哺乳动物细胞基因表达调控的认识以及对乙型肝炎病毒的分子结构和免疫反应的了解，经过长期试验研究，终于达到了上述目的。本专利技术提供了一种新型的乙型肝炎治疗性疫苗，该疫苗以质粒脱氧核糖核酸(DNA)为基础，用含有乙型肝炎病毒表面抗原多肽(pre S多肽及完整的HBSAg)基因的转录及蛋白合成的DNA连接入质粒载体。所述的质粒载体含有来自人类巨细胞病毒(Maniatis,T、et.al.,1982,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(Cold Spring HarborLaboratory))的高效哺乳动物细胞转录启动子及增强子，并带有核糖核酸稳定序列、哺乳动物细胞DNA复制起动顺序及带有能增强免疫效果的抗生素选择基因(如抗氨苄青霉素基因)。其中转录启动子及增强子顺序使得乙肝表面抗原基因得以高效转录，核糖核酸稳定序列使转录的乙肝表面抗原信使核糖核酸不致裂解。哺乳动物DNA复制起动顺序使得质粒能在动物细胞内复制，因而达到更高表达效果。大肠杆菌DNA复制起动顺序及抗生素选择基因(如抗氨苄青霉素基因)则使质粒得以在大肠杆菌内复制扩增而使得大量提纯DNA成为可能。同时此抗氨苄青霉素基因也带有能增强免疫效果的序列，因而在动物及人体注射后能产生有保护作用的免疫反应。上述疫苗质粒中包括有、以及三种不同组分，其中所用的乙型肝炎表面抗原多肽基因的序列如下1．肽序列MGGWSSKPRKGMGTNLSVPNP本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乙型肝类治疗性疫苗，所述疫苗以质粒脱氧核糖核酸（ＤＮＡ）为基础，用含有乙型肝炎病毒表面抗原多肽（ｐｒｅＳ多肽及完整的ＨＢＳＡｇ）基因的转录及蛋白合成的ＤＮＡ连接入质粒［ＰｒｅＳ２＋ＨＢｓＡｇ］载体构成，其特征在于所述质粒疫苗包括有［ｐｒｅＳ１＋ｐｒｅＳ２＋ＨＢＳＡｇ］、［ｐｒｅＳ２＋ＨＢＳＡｇ］以及［ＨＢＳＡｇ］三种不同组分，其中所用的乙型肝炎表面抗原多肽基因的序列如下： １．肽序列： ＭＧＧＷＳＳＫＰＲＫＧＭＧＴＮＬＳＶＰＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰＡＦＧＡＮＳＮＮＰＤＷＤＦＮＰＶＫＤＤ ＷＰＡＡＮＱＶＧＶＧＡＦＧＰＲＬＴＰＰＨＧＧＩＬＧＷＳＰＱＡＱＧＩＬＴＴＶＳＴＩＰＰＰＡＳＴＮＲＱＳＧＲＱ ＰＴＰＩＳＰＰＬＲＤＳＨＰＱＡＭＱＷＮＳＴＡＦＨＱＴＬＱＤＰＲＶＲＧＬＹＬＰＡＧＧＳＳＳＧＴＶＮＰＡＰＮＩ ＡＳＨＩＳＳＩＳＡＲＴＧＤＰＶＴＮＭＥＮＩＴＳＧＦＬＧＰＬＬＶＬＱＡＧＦＦＬＬＴＲＩＬＴＩＰＱＳＬＤＳＷＷＴＳＬ ＮＦＬＧＧＳＰＶＣＩＧＱＮＳＱＳＰＴＳＮＨＳＦＴＳＣＰＰＩＣＰＧＹＲＷＭＣＬＲＲＦＩＩＦＬＦＩＬＬＬＣＬＩＦＬＬＶ ＬＬＤＹＱＧＭＬＰＶＣＰＬＩＰＧＳＴＴＴＳＴＧＰＣＫＴＣＴＴＰＡＱＧＮＳＭＦＰＳＣＣＣＴＫＰＴＤＧＮＣＴＣＩ ＰＩＰＳＳＷＡＦＡＫＹＬＷＥＷＡＳＶＲＦＳＷＬＳＬＬＶＰＦＶＱＷＦＶＧＬＳＰＴＶＷＬＳＡＩＷＭＭＷＹＷ ＧＰＳＬＹＳＩＶＳＰＦＩＰＬＬＰＩＦＦＣＬＷＶＹＩ ２．核苷酸序列： ＡＴＧＧＧＡＧＧＴＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＡＡＣＣＴＣＧＣＡＡＡＧＧＣＡＴＧＧＧＧＡＣＧＡＡＣＣＴＴＴＣＴ ＧＴＴＣＣＣＡＡＣＣＣＴＣＴＧＧＧＡＴＴＣＴＴＴＣＣＣＧＡＴＣＡＴＣＡＧＴＴＧＧＡＣＣＣＴＧＣＡＴＴＣＧ ＧＡＧＣＣＡＡＣＴＣＡＡＡＣＡＡＴＣＣＡＧＡＴＴＧＧＧＡＣＴＴＣＡＡＣＣＣＣＡＴＣＡＡＧＡＡＣＣＡＣＴＧ ＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＡＡＣＣＡＧＧＴＡＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＣＡＴＴＣＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＴＣＡＣＣＣ ＣＴＣＣＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＡＴＴＴＴＧＧＧＧＴＧＧＡＧＣＣＣＴＣＡＧＧＣＴＣＡＧＧＧＣＡＴＡＴＴＧＡ ＣＣＡＣＡＧＴＧＴＣＡＡＣＡＡＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＴＣＧＧＣＡＧＴＣＡＧＧＡＡ ＧＧＣＡＧＣＣＴＡＣＴＣＣＣＡＴＣＴＣＴＣＣＡＣＣＴＣＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＴＣＡＴＣＣＴＣＡＧＧＣＣＡ ＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＴＴＣＣＡＣＴＧＣＣＴＴＣＣＡＣ...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：饶纬华，
申请(专利权)人：北京爱德英生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]