本发明专利技术公开了一种靶向治疗实体瘤的双歧杆菌ｐＢＥＳ－ｔｋ重组载体，采用序列表中的ＳＥＱ?ＩＤ?Ｎｏ：１做为表达载体，即双歧杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体ｐＢＥＳ；所述靶向治疗实体瘤的双歧杆菌ｐＢＥＳ－ｔｋ重组载体具有序列表中的ＳＥＱ?ＩＤ?Ｎｏ：２所表示的ｔｋ基因序列，该基因为发挥治疗效应目的基因，可择性地杀死肿瘤细胞达到治疗实体瘤的目的。本发明专利技术运用基因工程方法将ｔｋ基因连接到双歧杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体ｐＢＥＳ中，通过质粒转化方法把ｔｋ基因导入到人体生菌－双歧杆菌中制成双歧杆菌为表达载体的ｔｋ重组载体肿瘤基因治疗系统，即双歧杆菌ｐＢＥＳ－ｔｋ重组载体靶向治疗实体瘤的双歧杆菌ｐＢＥＳ－ｔｋ重组载体。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种重组载体，特别涉及一种靶向治疗实体瘤的双歧杆菌pBES-tk重 组载体及其用途。
技术介绍
肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一，人类全身肿瘤中90%以上常见的恶性肿 瘤都是实体瘤；随着环境污染的加剧，其发病率逐年上升。实体瘤的传统治疗方法以手术、 化疗及放疗为主，但肿瘤的转移率和治疗后的复发率都较高，生存率仍不理想。因此，结合 最新的肿瘤生理学和医学分子生物学研究成果，进一步研究开发新型高效的实体瘤治疗方 法，具有重要的社会经济意义。利用自杀基因治疗实体瘤是近年来肿瘤基因治疗的研究热点。所谓自杀基因治疗 肿瘤就是用基因工程技术将特定的外源基因导入肿瘤宿主细胞或肿瘤组织中，该外源基因 表达的蛋白质能够将无毒的前体药物分解成对肿瘤细胞有毒性的药物成分，直接杀死肿瘤 细胞，从而达到治疗肿瘤的目的。然而，目前基因治疗面临的关键问题是如何解决载体的安 全性和靶向性问题，选择一个高效、安全、特异性强的载体，是实现目的基因在肿瘤细胞中 特异表达的前提。I 型单纯疱疫病毒胸苷激酶基因(herpes simplex virus-1 thymidinekinase, HSV-TK)/丙氧鸟苷(ganciclovir，GCV)是目前研究最早最彻底的，广泛用于肿瘤基因治疗 的自杀基因系统之一。目前研究认为该自杀基因治疗肿瘤的机制有两个一是自杀效应，即 HSV-TK编码由376个氨基酸组成的胸甘激酶，导入肿瘤细胞后，这种胸苷激酶将无毒的丙 氧鸟苷(GCV)磷酸化成单磷酸丙氧鸟苷，再进一步磷酸化为三磷酸丙氧鸟苷后，掺合到新 合成的肿瘤细胞DNA链中，使DNA链断裂且抑制DNA聚合酶活性，从而干扰DNA合成导致肿 瘤细胞死亡。另外一种是TK-GCV系统引发的“旁观者效应”，所谓“旁观者效应”即是转导的 肿瘤细胞被敏感药物杀死的同时，周围未被转导的肿瘤细胞也被杀死的现象。HSV-TK/GCV 系统通过这种独特的自杀效应或“旁观者效应”能选择性地杀死肿瘤细胞，保护正常组织细 胞，从而避免传统的化疗等治疗方法对人体带来的伤害。自1986年Moolten首先报道腺病 毒介导的HSV-TK基因可使肿瘤获得对某些药物的敏感性以来，国内外学者陆续将腺病毒 介导的HSV-TK基因应用于肝癌、胃癌、舌癌、前列腺癌、黑色素瘤等实体瘤的基因治疗的实 验研究，并取得了可喜进展。然而，寻找安全有效的tk基因表达载体仍然是困扰HSV-TK基 因治疗的一大难题。肿瘤基因治疗的载体系统主要有病毒载体和非病毒载体(脂质体等)两大类。由 于病毒载体本身有很多局限性，如病毒滴度低、生产成本高、靶向性差；同时，对某些静止期 细胞无感染性(腺病毒载体)、宿主范围有限、插入宿主基因组可能引起突变及病毒本身缺 乏安全性等缺点，因而不能满足临床应用需要，使得该项技术还处在摸索阶段。脂质体等非 病毒载体，普遍存在基因转染效率低、缺乏肿瘤特异靶向性等缺点。因而寻找一种高效、特3异、安全的载体系统成为近年来研究的热点。研究表明，厌氧细菌具有良好的肿瘤靶向定植性，许多抗肿瘤研究已经尝试以厌 氧菌作为转移载体携带各种抑瘤基因到肿瘤组织处进行肿瘤基因治疗。厌氧菌载体的应用 解决了传统基因治疗载体(病毒载体或非病毒载体)靶向性不强的问题，避免载体在到达 肿瘤细胞的过程中所要面临的生理和免疫上的多重障碍，提高了治疗基因在体内的表达水 平。目前，广泛研究的厌氧菌包括梭状芽孢杆菌属、沙门氏菌属和双歧杆菌属等。沙门氏菌 是革兰氏阴性菌，菌体含有内毒素，安全性要比双歧杆菌差。双歧杆菌(bifidobacterium)属于革兰氏阳性菌，严格厌氧菌，不产生外毒素，不 含有内毒素，本身无致病性；该菌是人体中的重要益生菌，在健康人肠道内定植且占有一定 数量优势细菌，广泛用于各种奶制品发酵，其非致病性在许多国家已经得以接受，美国食品 与药物管理局(FDA)将该菌的安全级别定为最高级一A级。Li等将转人内皮抑素的双歧 杆菌经尾静脉注射荷瘤小鼠，发现抑瘤效果比天然双歧杆菌更好。2008年Do Kyung Lee 等人用实验证实人源双歧杆菌能显著提高人的自身免疫并且抑制结肠癌细胞株的生长，并 诱导肿瘤细胞凋亡。这些研究提示双歧杆菌可以作为肿瘤基因治疗靶向载体系统。已有 研究证明在实体瘤中存在一些低氧区域(尤其是瘤体的中央区)，而这些低氧区域适合厌 氧菌的存活。Vaupel等研究了肿瘤组织中的氧分压，发现恶性实体瘤中心区域氧分压低至 2. 5mmHg以下，远低于正常组织的24-66mmHg，这表明恶性实体瘤中心区域较正常组织更适 合双歧杆菌的生存。申请者在前期研究中连续4天将Iml浓度为2. OX 104/ml的人双歧杆 菌活菌通过耳静脉注入健康家兔(2. OKg)，血培养法结果证明双歧杆菌入血后，不会在血 液中大量繁殖和生存，不会出现高热和休克等菌血症表现；实验组家兔脾、肾、骨骼肌、心肌 和癌旁肝组织经病理学检测未见明显异常。这些研究均表明双歧杆菌作为肿瘤基因治疗靶 向载体系统具有较高的安全性。作为肿瘤基因肿瘤载体系统，双歧杆菌的优越性在于第一、作为一种胞外菌，双 歧杆菌自身的繁殖不依赖于肿瘤细胞活动周期，也不借助宿主细胞的各种因子启动和调控 目的基因的表达，无组织特异性限制，对复制和静息的肿瘤细胞均有作用。第二、双歧杆菌 的基因组和外源基因都不可能插入宿主基因组，不会引发宿主基因突变的风险。第三、双歧 杆菌对实体瘤的趋化性是针对中心的厌氧区的氧分压，不对肿瘤的部位和性质，具有广泛 的实用性，不需要对肿瘤特异基因的鉴定和了解，而且该细菌具备不依赖宿主生命周期的 独立繁殖能力，理论上讲，只要有一个细菌能够顺利到达肿瘤的厌氧坏死区，就能够繁殖出 成千上万个细菌，在局部形成高活性区，有可能改变现有载体系统转导效率低的状况，这表 明双歧杆菌作为载体系统具有较高转导效率。综上所述，双歧杆菌作为肿瘤基因治疗的载 体系统具有较高的特异性、高效性和安全性，有可能克服以往肿瘤基因治疗中缺乏肿瘤组 织靶向性、安全性和转导效率低等“瓶颈”。就目前国内外发表的以双歧杆菌为表达载体进行肿瘤基因治疗的文献而言， 其表达系统大体上有三类一种是以PGEX-5X-1为主；另一种是以PBV220为主；第三 类是主要以研究者自己分离和构建的载体系统为主，如Kano等改造的来源于pTB6的 pAV001-HU-eCD-M968等。他们的共同特点是大多采用了氨苄青霉素为筛选基因，因此，其临 床应用的安全风险非常大，本专利技术针对上述表达载体的优缺点，研发出一套安全高效的靶 向治疗实体瘤的双歧杆菌pBES-tk重组载体，经专利查新证实，国内目前关于人用靶向治疗实体瘤的双歧杆菌pBES-tk重组载体的专利未见公布。
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对现有技术的不足，提供一种靶向治疗实体瘤的 双歧杆菌PBES-tk重组载体及其用途。本专利技术同时提供了 一种靶向治疗实体瘤的双歧杆菌 pBES-tk重组载体的构建方法。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案一种靶向治疗实体瘤的双歧杆菌pBES-tk重组载体，其特征在于采用序列表中 的SEQ IDNo 1做为表达载体，即双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体pBES ；所述靶向治疗 实体瘤的双歧杆菌pBES-t本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
一种靶向治疗实体瘤的双歧杆菌pBES tk重组载体，其特征在于采用序列表中的SEQ ID №1做为表达载体；所述靶向治疗实体瘤的双歧杆菌pBES tk重组载体具有序列表中的SEQ ID №2所表示的tk基因序列。2.一种靶向治疗实体瘤的双歧杆菌pBES-tk重组载体的用途，其特征在于用于靶向 治疗实体瘤。3.权利要求1所述靶向治疗实体瘤的双歧杆菌pBES-tk重组载体的构建方法，其特征 在于包括以下步骤第一步，先用基因合成方法合成GenBank号为AB032875的HSV-Itk基因，其序列特征 为SEQ ID No 2 ；在其5-端添加BamHI酶切位点，3’端添加SalI酶切位点，然后将合成的 tk基因片段克隆到pGH克隆载体中，测序检测正确后备用，命名为pGH-tk ；第二步，将PGH-tk和pBES质粒分别转化大肠杆菌DH5 α，37°C培养10小时后纯化质 粒，将纯化的pGH-tk和pBES质粒分别用BamHI和SalI双酶切，电泳分离后用凝胶纯化试 剂盒(北京鼎国生物生产)分离纯化...
【专利技术属性】
技术研发人员：马永平，宋方洲，唐伟，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：85
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。