【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本申请涉及基因疗法和分子生物学领域。更具体地，本专利技术涉及来自腺相关病毒血清型9(aav9)的分离的修饰衣壳蛋白vp1、基于上述vp1的衣壳和载体以及其用途，所述分离的修饰衣壳蛋白vp1与野生型aav9衣壳蛋白vp1相比，包含一个或多个氨基酸取代，这些取代提高了基于重组腺相关病毒血清型9(raav9)的载体的产生(组装)效率。
技术介绍
1、腺相关病毒(aav)是一种小的(25nm)、自主复制缺陷的无包膜病毒。已经在人和灵长类中描述了许多不同的aav血清型。腺相关病毒基因组由长度约为4,700个核苷酸的(+或-)单链dna(ssdna)构成。在基因组dna分子的末端容纳有反向末端重复(itr)。基因组包含两个开放阅读框(orf)：rep和cap，其包含编码各种蛋白产物的几个替代阅读框。rep产物对于aav复制至关重要，而三种衣壳蛋白(vp1、vp2和vp3)以及其他替代产物由cap基因编码。vp1、vp2和vp3蛋白以1:1:10的比例存在，以形成二十面体衣壳(xie q.等人the atomicstructure of adeno-associated virus(aav-2),a vector for human genetherapy.proc natl acad sci usa,2002；99:10405-10410)。在重组aav(raav)载体产生期间，将侧翼有itr的表达盒包装到aav衣壳中。aav复制所需的基因不包括在盒中。重组aav被认为是用于体内基因转移的最安全和最广泛使用的病毒载体之一。载体可以感染多种组
2、在开发有效的基因疗法领域中研究的紧迫目的之一是优化载体以改善给定载体的某些特性。
3、各种aav血清型的特征是对不同宿主细胞表面受体的亲和力，它们对这些受体具有向性。因此，aav2的主要已知受体是硫酸乙酰肝素蛋白多糖，共受体是整合素异二聚体avβ5、成纤维细胞生长因子受体1型和肝细胞生长因子受体c-met。aav12与硫酸乙酰肝素蛋白多糖和唾液酸结合。aav4和aav5分别与n-和o-连接的唾液酸结合。aav5激活血小板源性生长因子受体。此外，已经在aav衣壳蛋白的氨基酸序列与其组装过程、基因组的包壳化、对宿主细胞表面上所展示的不同类型受体的亲和力之间建立了关系(govindasamy l.等人.structural insights into adeno-associated virus serotype 5.j virol.2013oct；87(20):11187-99)。
4、国际申请wo2012145601描述了具有变体衣壳蛋白的腺相关病毒(aav)病毒粒子，其中与野生型aav相比，当通过玻璃体内注射施用时，所述aav病毒粒子表现出更大的视网膜细胞感染性。
5、国际申请wo2013158879描述了用于向受试者递送异源核酸序列的腺相关病毒(aav)载体，所述载体包含含有一个或多个赖氨酸取代的衣壳蛋白vp1，其中一个赖氨酸取代为k137r，其中所述赖氨酸取代对抑制所述衣壳蛋白的泛素化有效，从而提高了所述avv载体在靶标细胞中的转导效率。
6、迄今为止，需要高效产生(组装)基于重组腺相关病毒血清型9(raav9)的包壳病毒载体，即需要有效产生包含转基因的基于重组腺相关病毒血清型9(raav9)的病毒载体(包壳异源核酸)。
技术实现思路
1、本专利技术的作者出乎意料地发现，当与基于野生型raav9(无下述突变)的包壳病毒载体的组装相比，野生型aav9衣壳蛋白vp1中一个或多个氨基酸取代的存在引起基于重组腺相关病毒血清型9(raav9)的包壳病毒载体的高效产生(组装)，所述氨基酸取代选自：
2、f422w，
3、f422w和y446f，
4、i601m，
5、即当与基于野生型raav9(无上述突变)的包壳病毒载体的组装相比，在aav9衣壳中包含上述修饰的基于raav9的包壳病毒载体的组装导致含有转基因的基于raav9的病毒载体(包壳异源核酸)的产生显著更为频繁。
6、专利技术的简要描述
7、在一个方面，本专利技术涉及一种来自腺相关病毒血清型9(aav9)的分离的修饰衣壳蛋白vp1，其用于高效产生(组装)基于重组腺相关病毒血清型9(raav9)的包壳病毒载体，所述分离的修饰衣壳蛋白vp1包含由cap基因编码的野生型aav9衣壳蛋白vp1的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有一个或多个选自以下的取代：
8、f422w，
9、f422w和y446f，
10、i601m，其中野生型aav9衣壳蛋白vp1氨基酸序列具有由seq id no:1表示的氨基酸序列。
11、在本专利技术的一些实施方案中，分离的修饰aav9衣壳蛋白vp1包含在f422w位的取代。
12、在一些实施方案中，分离的修饰aav9衣壳蛋白vp1具有由seq id no:2表示的氨基酸序列。
13、在本专利技术的一些实施方案中，分离的修饰aav9衣壳蛋白vp1包含取代f422w和y446f。
14、在本专利技术的一些实施方案中，分离的修饰aav9衣壳蛋白vp1具有由seq id no:3表示的氨基酸序列。
15、在本专利技术的一些实施方案中，分离的修饰aav9衣壳蛋白vp1包含取代i601m。
16、在本专利技术的一些实施方案中，分离的修饰aav9衣壳蛋白vp1具有由seq id no:4表示的氨基酸序列。
17、在一个方面，本专利技术涉及一种分离的核酸，其编码上述来自腺相关病毒血清型9(aav9)的修饰衣壳蛋白vp1的任一种，所述修饰衣壳蛋白vp1用于高效产生(组装)基于重组腺相关病毒血清型9(raav9)的包壳病毒载体。
18、在本专利技术的一些实施方案中，分离的核酸编码具有氨基酸取代f422w的来自腺相关病毒血清型9(aav9)的修饰衣壳蛋白vp1，并且由具有seq id no:6的核酸序列或由编码相应氨基酸序列的任何其他序列表示。
19、在本专利技术的一些实施方案中，分离的核酸编码具有氨基酸取代f422w和y446f的来自腺相关病毒血清型9(aav9)的修饰衣壳蛋白vp1，并且由具有seq id no:7的核酸序列或由编码相应氨基酸序列的任何其他序列表示。
20、在本专利技术的一些实施方案中，分离的核酸编码具有氨基酸取代i601m的来自腺相关病毒血清型9(aav9)的修饰衣壳蛋白vp1，并且由具有seq id no:8的核酸序列或由编码相应氨基酸序列的任何其他序列表示。
21、在一个方面，本专利技术涉及一种分离的衣壳，其用于高效产生(组装)基于重组腺相关病本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种来自腺相关病毒血清型9(AAV9)的分离的修饰衣壳蛋白VP1，其用于高效产生基于重组腺相关病毒血清型9(rAAV9)的包壳病毒载体，所述分离的修饰衣壳蛋白VP1包含由Cap基因编码的野生型AAV9衣壳蛋白VP1氨基酸序列，所述氨基酸序列具有一个或多个选自以下的取代：
2.根据权利要求1所述的分离的修饰AAV9衣壳蛋白VP1，其包含在F422W位的取代。
3.根据权利要求2所述的分离的修饰AAV9衣壳蛋白VP1，其具有由SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的分离的修饰AAV9衣壳蛋白VP1，其包含取代F422W和Y446F。
5.根据权利要求4所述的分离的修饰AAV9衣壳蛋白VP1，其具有由SEQ ID NO:3表示的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的分离的修饰AAV9衣壳蛋白VP1，其包含取代I601M。
7.根据权利要求6所述的分离的修饰AAV9衣壳蛋白VP1，其具有由SEQ ID NO:4表示的氨基酸序列。
8.一种分离的核酸，其编码根据权利要求1至7中
9.根据权利要求8所述的分离的核酸，其编码具有氨基酸取代F422W的来自腺相关病毒血清型9的修饰衣壳蛋白VP1，所述分离的核酸由具有SEQ ID NO:6的核酸序列或由编码相应氨基酸序列的任何其他序列表示。
10.根据权利要求8所述的分离的核酸，其编码具有氨基酸取代F422W和Y446F的来自腺相关病毒血清型9的修饰衣壳蛋白VP1，所述分离的核酸由具有SEQ ID NO:7的核酸序列或编码相应氨基酸序列的任何其他序列表示。
11.根据权利要求8所述的分离的核酸，其编码具有氨基酸取代I601M的来自腺相关病毒血清型9的修饰衣壳蛋白VP1，所述分离的核酸由具有SEQ ID NO:8的核酸序列或由编码相应氨基酸序列的任何其他序列表示。
12.一种分离的衣壳，其用于高效产生基于重组腺相关病毒血清型9的包壳病毒载体，所述分离的衣壳包括根据权利要求1至7中任一项所述的来自腺相关病毒血清型9的修饰衣壳蛋白VP1。
13.根据权利要求12所述的分离的衣壳，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的来自腺相关病毒血清型9的修饰衣壳蛋白VP1、AAV9衣壳蛋白VP2或其修饰变体以及AAV9衣壳蛋白VP3或其修饰变体。
14.根据权利要求13所述的分离的衣壳，其包含野生型AAV9衣壳蛋白VP2。
15.根据权利要求14所述的分离的衣壳，其包含具有由SEQ ID NO:9表示的氨基酸序列的野生型AAV9衣壳蛋白VP2。
16.根据权利要求13所述的分离的衣壳，其包含来自腺相关病毒血清型9的修饰衣壳蛋白VP2。
17.根据权利要求16所述的分离的衣壳，其包含修饰AAV9衣壳蛋白VP2，所述修饰AAV9衣壳蛋白VP2包含取代F285W。
18.根据权利要求17所述的分离的衣壳，其包含修饰AAV9衣壳蛋白VP2，所述修饰AAV9衣壳蛋白VP2包含取代F285W并且具有由SEQ ID NO:10表示的氨基酸序列。
19.根据权利要求16所述的分离的衣壳，其包含修饰AAV9衣壳蛋白VP2，所述修饰AAV9衣壳蛋白VP2包含取代F285W和Y309F。
20.根据权利要求19所述的分离的衣壳，其包含修饰AAV9衣壳蛋白VP2，所述修饰AAV9衣壳蛋白VP2包含取代F285W和Y309F并且具有由SEQ ID NO:11表示的氨基酸序列。
21.根据权利要求16所述的分离的衣壳，其包含修饰AAV9衣壳蛋白VP2，所述修饰AAV9衣壳蛋白VP2包含取代I464M。
22.根据权利要求21所述的分离的衣壳，其包含修饰AAV9衣壳蛋白VP2，所述修饰AAV9衣壳蛋白VP2包含取代I464M并且具有由SEQ ID NO:12表示的氨基酸序列。
23.根据权利要求13所述的分离的衣壳，其包含野生型AAV9衣壳蛋白VP3。
24.根据权利要求23所述的分离的衣壳，其包含具有由SEQ ID NO:17表示的氨基酸序列的野生型AAV9衣壳蛋白VP3。
25.根据权利要求13所述的分离的衣壳，其包含来自腺相关病毒血清型9的修饰衣壳蛋白VP3。
26.根据权利要求25所述的分离的衣壳，其包含修饰AAV9衣壳蛋白VP3，所述修饰AAV9衣壳蛋白VP3包含取代F220W。...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种来自腺相关病毒血清型9(aav9)的分离的修饰衣壳蛋白vp1，其用于高效产生基于重组腺相关病毒血清型9(raav9)的包壳病毒载体，所述分离的修饰衣壳蛋白vp1包含由cap基因编码的野生型aav9衣壳蛋白vp1氨基酸序列，所述氨基酸序列具有一个或多个选自以下的取代：
2.根据权利要求1所述的分离的修饰aav9衣壳蛋白vp1，其包含在f422w位的取代。
3.根据权利要求2所述的分离的修饰aav9衣壳蛋白vp1，其具有由seq id no:2表示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的分离的修饰aav9衣壳蛋白vp1，其包含取代f422w和y446f。
5.根据权利要求4所述的分离的修饰aav9衣壳蛋白vp1，其具有由seq id no:3表示的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的分离的修饰aav9衣壳蛋白vp1，其包含取代i601m。
7.根据权利要求6所述的分离的修饰aav9衣壳蛋白vp1，其具有由seq id no:4表示的氨基酸序列。
8.一种分离的核酸，其编码根据权利要求1至7中任一项所述的来自腺相关病毒血清型9的修饰衣壳蛋白vp1，所述衣壳蛋白vp1用于高效产生基于重组腺相关病毒血清型9的包壳病毒载体。
9.根据权利要求8所述的分离的核酸，其编码具有氨基酸取代f422w的来自腺相关病毒血清型9的修饰衣壳蛋白vp1，所述分离的核酸由具有seq id no:6的核酸序列或由编码相应氨基酸序列的任何其他序列表示。
10.根据权利要求8所述的分离的核酸，其编码具有氨基酸取代f422w和y446f的来自腺相关病毒血清型9的修饰衣壳蛋白vp1，所述分离的核酸由具有seq id no:7的核酸序列或编码相应氨基酸序列的任何其他序列表示。
11.根据权利要求8所述的分离的核酸，其编码具有氨基酸取代i601m的来自腺相关病毒血清型9的修饰衣壳蛋白vp1，所述分离的核酸由具有seq id no:8的核酸序列或由编码相应氨基酸序列的任何其他序列表示。
12.一种分离的衣壳，其用于高效产生基于重组腺相关病毒血清型9的包壳病毒载体，所述分离的衣壳包括根据权利要求1至7中任一项所述的来自腺相关病毒血清型9的修饰衣壳蛋白vp1。
13.根据权利要求12所述的分离的衣壳，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的来自腺相关病毒血清型9的修饰衣壳蛋白vp1、aav9衣壳蛋白vp2或其修饰变体以及aav9衣壳蛋白vp3或其修饰变体。
14.根据权利要求13所述的分离的衣壳，其包含野生型aav9衣壳蛋白vp2。
15.根据权利要求14所述的分离的衣壳，其包含具有由seq id no:9表示的氨基酸序列的野生型aav9衣壳蛋白vp2。
16.根据权利要求13所述的分离的衣壳，其包含来自腺相关病毒血清型9的修饰衣壳蛋白vp2。
17.根据权利要求16所述的分离的衣壳，其包含修饰aav9衣壳蛋白vp2，所述修饰aav9衣壳蛋白vp2包含取代f285w。
18.根据权利要求17所述的分离的衣壳，其包含修饰aav9衣壳蛋白vp2，所述修饰aav9衣壳蛋白vp2包含取代f285w并且具有由seq id no:10表示的氨基酸序列。
19.根据权利要求16所述的分离的衣壳，其包含修饰aav9衣壳蛋白vp2，所述修饰aav9衣壳蛋白vp2包含取代f285w和y309...
【专利技术属性】
技术研发人员：A·N·斯特雷科娃，T·E·舒加娃，P·M·格绍维奇，P·A·亚科夫列夫，D·V·莫洛佐夫，
申请(专利权)人：拜奥卡德联合股份公司，
类型：发明
国别省市：
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