【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
专利
本专利技术涉及生物，具体地讲涉及包括基于mhc(主要组织相容性复合体)或mhc样蛋白(cd1(分化簇1)或hfe(血色素沉着蛋白))的膜近端结构域的异源二聚体的二价双特异性嵌合抗体，以及用于产生所述双特异性抗体的技术。本专利技术进一步涉及编码所述双特异性抗体的核酸、表达载体、用于产生所述二价嵌合双特异性抗体的宿主细胞以及用于产生所述细胞的方法。
技术介绍
0、专利技术背景
1、呈嵌合、人源化或全人类分子形式的单克隆抗体已经证明用作治疗多种障碍和疾病的有效药物。
2、天然存在的人类抗体分子由两条重链同源二聚体组成，其每一条与两个相同的轻链分子合作形成异源二聚体。呈全分子形式的常规单克隆抗体由重链和轻链的二价(“双臂”)异源二聚体组成。
3、疾病通常由于几种病理学引起，并且伴有许多伴生疾病。双特异性抗体能够结合并且从而中和两种或更多种不同抗原/抗体分子。与单克隆抗体相比较，医药产品在治疗特性(和价值)方面的显著改善潜力使双特异性抗体成为活跃的研究领域。在过去的二十年里，文献描述了许多关于双特异性抗体的改造版本的解决方案，如brinkmann,u和rekontermann,2017,the making ofbispecific antibodies,mabs；209feb/mar；9(2):182-212,doi:10.1080/19420862.2016.1268307所述。
4、如上所述，存在许多方法来创建具有组合抗原结合结构域，即具有彼此不同的抗原结合结构域的分子。然
5、通过化学方法交联为一种耗时的过程，因为同源二聚体和其他不合期望的副产物应当从相应部分中去除。另外，化学修饰的步骤可能改变蛋白的完整性，从而损害其稳定性。因此，以上方法一般地无效，并且可能导致抗体活性的丧失。
6、一种基于细胞融合(例如杂交瘤的产生)的方法为任意组装两条重链和两条轻链，产生10种抗体组合。靶异源多聚体抗体仅为以这种方式产生的抗体的一小部分。靶异源多聚体蛋白的分离显著降低产物的产率并增加生产成本。
7、重组dna技术用于创建各种异源多聚体抗体，例如单链fv片段、双体抗体等，其不含fc片段。这种类型抗体分子的主要缺点为缺少fc结构域，这导致抗体无法触发效应子功能(比如补体激活、与fc受体结合等)。因此，需要包含功能性fc结构域的双特异性抗体。
8、重组dna技术进一步用于使用旋钮入孔(knob-into-holes)技术设计双特异性抗体。参见国际申请wo9627011和wo9850431以及merchant am等人,an efficient route tohuman bispecific igg,nat biotechnol.1998jul；16(7):677-81。限制以上方法使用的一个因素为以下事实：当在单个细胞中表达时，两种初始抗体的轻链应为相同的，以防止错配和形成不合期望的和/或非活性的分子。
9、双特异性抗体产物的纯度取决于如下两个因素：
10、a)细胞中共表达的两条不同重链的异源二聚体组装，和
11、b)使两条不同轻链与相应的重链正确配对。
12、设计双特异性抗体的“旋钮入孔”技术解决了细胞中共表达的两条不同重链的异源二聚体正确组装问题。然而，由于两条不同轻链与相应重链的正确配对问题仍未解决，因此使用旋钮入孔技术设计双特异性抗体使适当组装的双特异性产物的产率仅可达到约25％。
13、两条不同轻链与相应重链的正确配对问题以各种方式解决：
14、1.在抗体的第一和第二抗原结合部分中使用(相同的)轻链(van blarcom t等人,productive common light chain libraries yield diverse panels of high affinitybispecific antibodies,mabs.2018feb/mar；10(2):256-268.doi:10.1080/19420862.2017.1406570)。
15、以上解决方案的缺点为其非普适性，因为选择适合于两种效价的轻链可能是有问题的。此外，轻链中的氨基酸取代以优化抗原结合片段的特性可能会影响这两种效价。进一步地，抗体与第二抗原的结合可能被破坏。
16、2.使用单链格式，即其中对第一抗原具有特异性的抗原结合片段的轻链和重链经几个氨基酸的接头相互连接的格式。
17、这种格式存在技术缺点，因为其使用接头将抗体核心(iga、igd、ige、igg或igm)融合于另一种结合蛋白(例如scfv或scfab)，或者将例如scfv内的轻和重可变结构域(vh和vl)或轻链(vl-ck(或cl))融合于scfab内的vh-ch1。接头可能会在治疗环境中引起问题。事实上，这些外源肽可引起针对接头本身或蛋白与接头之间的连接区的免疫反应。此外，这些肽的灵活性及其移动性使其更易于蛋白水解切割，可能导致抗体稳定性差、聚集和免疫原性增加。
18、3.修饰双特异性抗体中的ch1-ck结构域，以允许改变双特异性抗体表达技术中的相互作用界面，以便排除轻链的不正确缔合。例如，国际申请wo2017059551提供了促进期望的重链和期望的轻链之间优选配对的ch1和/或ck中的各种氨基酸取代。
19、尽管存在以上各种双特异性抗体表达技术，但本领域仍然需要提高双特异性抗体产物的纯度以及用于产生正确地组装的双特异性抗体的可扩展生产解决方案。
技术实现思路
0、专利技术简述
1、由本专利技术作者开发的包括基于mhc或mhc样蛋白(例如cd1(分化簇1)或hfe(人类稳态铁调节蛋白))的膜近端结构域的异源二聚体的新格式的双特异性嵌合抗体，以及用于产生所述双特异性嵌合抗体的技术，令人惊讶地使得可产生具有在细胞中共表达的两条不同重链的正确异源二聚体组装以及两条不同轻链和相应重链之间的正确配对的高产率产物。
2、由本专利技术作者开发的包括基于mhc或mhc样蛋白的膜近端结构域的异源二聚体的新格式的双特异性嵌合抗体，以及用于产生所述双特异性抗体的技术，令人惊讶地使得可以高纯度产生正确组装的双特异性嵌合抗体产物。
3、因此，以上结果降低生产成本并导致用于产生正确组装的双特异性抗体的可扩展生产解决方案。
4、在一方面，本专利技术涉及一种二价双特异性嵌合抗体，其中所述抗体包含：
5、a)特异性地结合于第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链；
6、其中第一轻链包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域；
7、其中第一重链包含抗体的重链可变结构域和包括第一(ch1)重链恒定结构域及包含第二(ch2)和第三(ch3)重链恒定结构域的fc片段单体的重链恒定结构域；
8、b)特异性地结合于第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，
9、其中第二轻链包含轻链可变结构域和本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种二价双特异性嵌合抗体，其中所述抗体包含：
2.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中MHC的第一膜近端结构域可选自：
3.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中MHC的第二膜近端结构域可选自：
4.权利要求2-3中任何一项的二价双特异性嵌合抗体，其中MHC II类选自：HLA-DM、HLA-DO、HLA-DP、HLA-DQ或HLA-DR。
5.权利要求2-3中任何一项的二价双特异性嵌合抗体，其中MHC I类选自：HLA-A、HLA-B、HLA-С、HLA-E、HLA-F或HLA-G。
6.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中MHC样蛋白的第一膜近端结构域可选自：
7.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中MHC样蛋白的第二膜近端结构域可选自：
8.权利要求6-7中任何一项的二价双特异性嵌合抗体，其中CD1选自：CD1a、CD1b、CD1c、CD1d或CD1e。
9.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中第二轻链(VL)的可变片段通过1-25个氨基酸长的接头与MHC或MHC样蛋
10.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中
11.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中抗体第一轻链的恒定结构域选自CK或CL。
12.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中抗体的CH3结构域通过将半胱氨酸(C)作为氨基酸引入到每个CH3结构域的相应位置使得可在两个CH3结构域之间形成二硫桥而进一步修饰。
13.权利要求10的二价双特异性嵌合抗体，其中一条重链的CH3结构域被修饰以形成旋钮，和另一条重链的CH3结构域被修饰以形成孔，或反之亦然。
14.权利要求13的二价双特异性嵌合抗体，其中一条重链的CH3结构域具有氨基酸取代S354C/T366W，和另一条重链的CH3结构域具有氨基酸取代Y349C/T366S/L368A/Y407V；或
15.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中MHC的第一膜近端结构域和MHC的第二膜近端结构域分别为在其间形成异源二聚体的MHC II的α2结构域和MHC II的β2结构域。
16.权利要求15的二价双特异性嵌合抗体，其中MHC II的α2结构域具有选自SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:38的氨基酸序列，和MHCII的β2结构域具有选自SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37或SEQID NO:39的氨基酸序列。
17.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中MHC的第一膜近端结构域和MHC的第二膜近端结构域分别为在其间形成异源二聚体的MHC II的β2结构域和MHC II的α2结构域。
18.权利要求17的二价双特异性嵌合抗体，其中MHC II的β2结构域具有选自SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:39的氨基酸序列，和MHCII的α2结构域具有选自SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36或SEQID NO:38的氨基酸序列。
19.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中MHC的第一膜近端结构域和MHC的第二膜近端结构域分别为在其间形成异源二聚体的MHC II的α2结构域修饰变体和MHC II的β2结构域修饰变体；或
20.权利要求19的二价双特异性嵌合抗体，其中MHC I的α3结构域具有选自SEQ ID NO:1-29的氨基酸序列，和β2微球蛋白(β2Μ)具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列。
21.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中MHC的第一膜近端结构域和MHC的第二膜近端结构域分别为在其间形成异源二聚体的β2微球蛋白(β2Μ)和MHC I的α3结构域。
22.权利要求21的二价双特异性嵌合抗体，其中β2微球蛋白(β2Μ)具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列和MHC I的α3结构域具有选自SEQ ID NO:1-29的氨基酸序列。
23.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中MHC的第一膜近端结构域和MHC的第二膜近端结构域分别为在其间形成异源二聚体的MHC I的α3结构域修饰变体和β2微球蛋白(β2Μ)修...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种二价双特异性嵌合抗体，其中所述抗体包含：
2.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中mhc的第一膜近端结构域可选自：
3.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中mhc的第二膜近端结构域可选自：
4.权利要求2-3中任何一项的二价双特异性嵌合抗体，其中mhc ii类选自：hla-dm、hla-do、hla-dp、hla-dq或hla-dr。
5.权利要求2-3中任何一项的二价双特异性嵌合抗体，其中mhc i类选自：hla-a、hla-b、hla-с、hla-e、hla-f或hla-g。
6.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中mhc样蛋白的第一膜近端结构域可选自：
7.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中mhc样蛋白的第二膜近端结构域可选自：
8.权利要求6-7中任何一项的二价双特异性嵌合抗体，其中cd1选自：cd1a、cd1b、cd1c、cd1d或cd1e。
9.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中第二轻链(vl)的可变片段通过1-25个氨基酸长的接头与mhc或mhc样蛋白的第一膜近端结构域隔开和/或第二重链(vh)的可变片段通过1-25个氨基酸长的接头与mhc或mhc样蛋白的第二膜近端结构域隔开。
10.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中
11.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中抗体第一轻链的恒定结构域选自ck或cl。
12.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中抗体的ch3结构域通过将半胱氨酸(c)作为氨基酸引入到每个ch3结构域的相应位置使得可在两个ch3结构域之间形成二硫桥而进一步修饰。
13.权利要求10的二价双特异性嵌合抗体，其中一条重链的ch3结构域被修饰以形成旋钮，和另一条重链的ch3结构域被修饰以形成孔，或反之亦然。
14.权利要求13的二价双特异性嵌合抗体，其中一条重链的ch3结构域具有氨基酸取代s354c/t366w，和另一条重链的ch3结构域具有氨基酸取代y349c/t366s/l368a/y407v；或
15.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中mhc的第一膜近端结构域和mhc的第二膜近端结构域分别为在其间形成异源二聚体的mhc ii的α2结构域和mhc ii的β2结构域。
16.权利要求15的二价双特异性嵌合抗体，其中mhc ii的α2结构域具有选自seq idno:30、seq id no:32、seq id no:34、seq id no:36或seq id no:38的氨基酸序列，和mhcii的β2结构域具有选自seq id no:31、seq id no:33、seq id no:35、seq id no:37或seqid no:39的氨基酸序列。
17.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中mhc的第一膜近端结构域和mhc的第二膜近端结构域分别为在其间形成异源二聚体的mhc ii的β2结构域和mhc ii的α2结构域。
18.权利要求17的二价双特异性嵌合抗体，其中mhc ii的β2结构域具有选自seq idno:31、seq id no:33、seq id no:35、seq id no:37或seq id no:39的氨基酸序列，和mhcii的α2结构域具有选自seq id no:30、seq id no:32、seq id no:34、seq id no:36或seqid no:38的氨基酸序列。
19.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中mhc的第一膜近端结构域和mhc的第二膜近端结构域分别为在其间形成异源二聚体的mhc ii的α2结构域修饰变体和mhc ii的β2结构域修饰变体；或
20.权利要求19的二价双特异性嵌合抗体，其中mhc i的α3结构域具有选自seq id no:1-29的氨基酸序列，和β2微球蛋白(β2μ)具有seq id no:46的氨基酸序列。
21.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中mhc的第一膜近端结构域和mhc的第二膜近端结构域分别为在其间形成异源二聚体的β2微球蛋白(β2μ)和mhc i的α3结构域。
22.权利要求21的二价双特异性嵌合抗体，其中β2微球蛋白(β2μ)具有seq id no:46的氨基酸序列和mhc i的α3结构域具有选自seq id no:1-29的氨基酸序列。
23.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中mhc的第一膜近端结构域和mhc的第二膜近端结构域分别为在其间形成异源二聚体的mhc i的α3结构域修饰变体和β2微球蛋白(β2μ)修饰变体；或
24.权利要求23的二价双特异性嵌合抗体，其中β2微球蛋白(β2μ)修饰变体具有选自seq id no:47或seq id no:48的氨基酸序列。
25.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中mhc样蛋白的第一膜近端结构域和mhc样蛋白的第二膜近端结构域分别为在其间形成异源二聚体的cd1的α3结构域和β2微球蛋白(β2μ)。
26.权利要求25的二价双特异性嵌合抗体，其中cd1的α3结构域具有选自seq id no:40-44的氨基酸序列，和β2微球蛋白(β2μ)具有seq id no:46的氨基酸序列。
27.权利要求1的二价双特异性嵌合抗体，其中mhc样蛋白的第一膜近端结构域和mhc样蛋白的第二膜近端结构域分别为在其间形成异源二聚体的β2微球蛋白(β2μ)和cd1的α3结构域。
28.权利要求27的二价双特异性嵌合抗体，其中β2微球蛋白(β2μ)具有seq ...
【专利技术属性】
技术研发人员：S·A·莱戈茨基，O·V·纳扎连科，M·A·达尼洛夫，M·D·巴拉诺夫斯卡亚，D·N·波利亚科夫，E·R·瓦利亚梅托娃，K·A·托波尔科娃，N·M·马秋希娜，S·M·克拉特，N·N·古利纳，P·A·雅科夫列夫，D·V·莫洛佐夫，
申请(专利权)人：拜奥卡德联合股份公司，
类型：发明
国别省市：
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