【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酶工程领域，特别涉及一种热稳定的果胶裂解酶突变体及其制备方法。
技术介绍
1、果胶（pectin）是植物细胞壁中层的一种天然成分，由α-1,4-糖苷键连接的半乳糖醛酸链组成，具有较高的甲基酯化率，并能与其他非纤维素材料形成网络，需要在多种果胶酶协同作用下才能够完全降解。果胶裂解酶（pectin lyases）是果胶酶家族中的一种重要的酶，可通过反式消除作用断开聚半乳糖醛酸的α-1,4-糖苷键，生成不饱和寡聚半乳糖醛酸，在制浆造纸行业中的木材脱胶、胶黏物控制以及脱墨等过程发挥着重要的作用，具有广阔的发展前景。然而天然的果胶裂解酶稳定性不好，在高温条件下容易失活，这严重限制了果胶裂解酶在工业上的应用。因此，筛选出热稳定性好的果胶裂解酶突变体，对于提高其工业应用效率以及促进相关工业的发展具有重要的作用。
2、目前常用的酶分子改造策略有定向进化（directed evolution）、理性设计（rational design）和半理性设计（semirational design）。定向进化通过对目标酶分子进行多轮突变、表达和筛选，从而获得所需功能的酶突变体。但是此法筛选工作量极大、耗时长、成本高，常因缺乏易实现的高通量筛选技术而受到限制。相反，理性设计和半理性设计通过计算模拟考察某位点突变对催化性能的影响，从而对酶定向进化进行设计指导和虚拟筛选，在酶工程领域发挥着重要的作用。
技术实现思路
1、为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的目的在于提供一种热稳定的果胶
2、本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
3、一种热稳定的果胶裂解酶pmgl-ba突变体，其氨基酸序列为seq id no.1经如下任意一种突变而得：
4、（1）s361n，即第361位氨基酸由s突变为k，其他同理；
5、（2）s361n，且r11h、q35p、s115p、v195i、r310l、r340w、y357f和k360y中的至少一个；
6、进一步的，热稳定的果胶裂解酶pmgl-ba突变体，其氨基酸序列为seq id no.1经如下任意一种突变而得：
7、s361n、q35p/s361n、s361n/r310l、s361n/k360y、s361n/r340w、s361n/v195i、y357f/s361n/r310l、r310l/k360y/s361n、k360y/s361n/y357f、r310l/r340w/y357f/s361n、r310l/r340w/y357f/k360y/s361n、r11h/r310l/r340w/y357f/k360y/s361n、r11h/q35p/r310l/r340w/y357f/k360y/s361n、r11h/s115p/r310l/r340w/y357f/k360y/s361n、r11h/q35p/s115p/v195i/r310l/r340w/y357f/k360y/s361n。
8、优选的，编码seq id no.1所示氨基酸序列的基因序列如seq id no.2所示。
9、一种所述突变体的编码基因。
10、优选的，一种热稳定的果胶裂解酶pmgl-ba突变体p36（r11h/q35p/s115p/v195i/r310l/r340w/y357f/k360y/s361n），所述突变体的氨基酸序列如seq id no.3所示。
11、具体，所述突变体p36的第11位、35位、115位、195位、310位、340位、357位、360位和361位发生突变，分别由精氨酸r突变为组氨酸h、谷氨酰胺q突变为脯氨酸p、丝氨酸s突变为脯氨酸p、缬氨酸v突变为异亮氨酸i、精氨酸r突变为亮氨酸l、精氨酸r突变为色氨酸w、酪氨酸y突变为苯丙氨酸f、赖氨酸k突变为酪氨酸y和丝氨酸s突变为天冬酰胺n。
12、一种如上述所述热稳定的果胶裂解酶pmgl-ba突变体p36的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。
13、上述突变体相关的生物材料，为下述生物材料中的任意一种或多种组合：
14、（a）含有上述编码基因的表达盒；
15、（b）含有上述编码基因的重组表达载体；
16、（c）含有（a）中所述表达盒的重组表达载体；
17、（d）含有上述编码基因的重组微生物；
18、（e）含有（a）中所述表达盒的重组微生物；
19、（f）含有（b）或（c）中所述重组表达载体的重组微生物。
20、进一步的，（b）、（c）中所述重组表达载体的出发载体为pet系列的载体或ppiczα载体等；优选为pet-28a(+)载体或ppiczαa载体。
21、进一步的，（d）、（e）、（f）中所述重组微生物对应的宿主微生物选自原核生物或酵母等；所述原核生物包括埃希氏菌属（ escherichia）等细菌；所述酵母包括毕赤酵母等酵母。更具体而言，所述原核生物是大肠杆菌（ escherichia coli， e.coli），具体可为大肠杆菌bl21(de3)；所述酵母是毕赤酵母x33或gs115。
22、一种固定化酶，含有上述突变体。
23、上述突变体、编码基因、突变体相关的生物材料或固定化酶在制备热稳定的果胶裂解酶pmgl-ba突变体中的应用。
24、上述突变体、编码基因、突变体相关的生物材料或固定化酶在降解果胶中的应用；
25、进一步的，上述突变体、编码基因、突变体相关的生物材料或固定化酶在造纸中的应用。
26、一种获得上述突变体的方法，包括如下步骤：通过设计引物对编码果胶裂解酶pmgl-ba的基因进行定点突变后表达。
27、进一步的，设计含有突变位点的引物向编码果胶裂解酶pmgl-ba的基因中引入突变，经测序正确后转化至大肠杆菌bl21(de3)中进行表达，得到热稳定的果胶裂解酶pmgl-ba突变体。
28、更进一步的，是以质粒pet-28a(+)-pmgl-ba为模板，设计含有突变位点的引物向编码果胶裂解酶pmgl-ba的基因中引入突变，然后转化至大肠杆菌top10中，随机挑取转化子提质粒进行测序。
29、一种热稳定的果胶裂解酶pmgl-ba突变体的酶活测定方本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种热稳定的果胶裂解酶PMGL-Ba突变体，其特征在于：所述果胶裂解酶PMGL-Ba突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1经如下任意一种突变而得：
2.根据权利要求1所述的热稳定的果胶裂解酶PMGL-Ba突变体，其特征在于：所述果胶裂解酶PMGL-Ba突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1经如下任意一种突变而得：
3.编码权利要求1或2所述的果胶裂解酶PMGL-Ba突变体的基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于：
5.权利要求1或2所述果胶裂解酶PMGL-Ba突变体相关的生物材料，其特征在于：为下述生物材料中的任意一种或多种组合：
6.根据权利要求5所述的生物材料，其特征在于：
7.一种固定化酶，其特征在于：含有权利要求1或2所述的果胶裂解酶PMGL-Ba突变体。
8.权利要求1～2任一项所述果胶裂解酶PMGL-Ba突变体、权利要求3～4任一项所述基因、权利要求5～6任一项所述生物材料或权利要求7所述固定化酶的应用，其特征在于：
9.一种获得权利要求1或2所述果胶
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：设计含有突变位点的引物向编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的果胶裂解酶PMGL-Ba的基因中引入突变，经测序正确后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，得到热稳定的果胶裂解酶PMGL-Ba突变体。
...【技术特征摘要】
1.一种热稳定的果胶裂解酶pmgl-ba突变体，其特征在于：所述果胶裂解酶pmgl-ba突变体的氨基酸序列为seq id no.1经如下任意一种突变而得：
2.根据权利要求1所述的热稳定的果胶裂解酶pmgl-ba突变体，其特征在于：所述果胶裂解酶pmgl-ba突变体的氨基酸序列为seq id no.1经如下任意一种突变而得：
3.编码权利要求1或2所述的果胶裂解酶pmgl-ba突变体的基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于：
5.权利要求1或2所述果胶裂解酶pmgl-ba突变体相关的生物材料，其特征在于：为下述生物材料中的任意一种或多种组合：
6.根据权利要求5所述的生物材料，其特征在于：
7.一种固定化酶，其特征在于：含有权...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩双艳，张智慧，杨曼丽，李治萱，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：
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