【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及pcr检测，具体地，涉及一种用于荧光定量pcr检测的引物、应用及检测方法。
技术介绍
1、多重探针熔解曲线分析法(multiplex pcr probe melting curve analysis)通过pcr技术结合荧光探针的熔解曲线分析技术，实现一个反应中同时检测多个靶标。常用的探针包括采用双标记和自淬灭的taqman探针或分子信标探针。检测原理为：当探针游离于溶液中处于无规则卷曲状态时，或分子信标由于茎部碱基的互补配对形成茎环结构时，探针上标记的荧光基团与淬灭基团相对靠近，荧光信号较弱；而当反应体系中存在靶标序列时，探针与靶标序列互补配对，形成伸展状态，荧光基团和淬灭基团相对远离，发射出较强的荧光信号。当扩增完成，产物量达到最高峰，荧光信号也最强，此时再对扩增产物进行升温检测，则杂交在产物上的探针与靶标序列逐渐解离，形成无规则卷曲状态，荧光信号逐渐减弱，绘制温度与荧光信号的变化曲线图，即可进行熔解曲线分析。
2、目前，多重探针熔解曲线分析法主要是基于taq dna聚合酶来实现的，主要策略是通过在其中一条扩增引物5’端添加一段外源序列(tag)，通过不对称聚合酶链式反应(as-pcr)产生大量含有与tag序列互补的扩增子序列，外源的荧光探针序列与tag序列的互补序列(ctag)结合，扩增之后进行熔解曲线分析产生一个熔解温度(tm)，通过设定不同的tag序列(改变探针与靶标序列的匹配程度)，即可产生多个不同的tm值，实现多重检测。该方法虽然能有效地实现多重熔解曲线分析，但是存在tag引物与荧光探针竞争
技术实现思路
1、为了解决现有技术中缺少用于多重探针熔解曲线分析法的高效、简便且特异性强的引物、探针和检测体系问题，本专利技术提供了一种用于荧光定量pcr检测的引物、应用及检测方法。
2、本专利技术的第一个目的是提供一种用于荧光定量pcr检测的引物。
3、本专利技术的第二个目的是提供所述引物在单重和/或多重荧光定量pcr检测中的应用。
4、本专利技术的第三个目的是提供一种用于多重荧光定量pcr检测的引物探针组合物。
5、本专利技术的第四个目的是提供所述引物探针组合物的在多重荧光定量pcr检测中的应用。
6、本专利技术的第五个目的是提供一种用于多重荧光定量pcr检测的组合物。
7、本专利技术的第六个目的是提供一种同步检测多个靶基因的多重荧光定量pcr检测方法。
8、为了实现上述目的，本专利技术是通过以下方案予以实现的：
9、本专利技术提供了一种适用于多重探针熔解曲线分析的新型发夹引物，该发夹引物包含了一段靶基因特异性识别序列(f)和一段茎环结构序列，茎环结构序列包含了茎部分(stem)区域和一段短的loop序列，该stem区域包含了荧光探针特异性识别序列(与荧光探针反向互补配对的序列，即top strand)和连接序列(bottom strand)，loop序列的3’端插入一个延伸阻滞基团。
10、当未进行pcr扩增反应时，发夹结构引物连接序列与荧光探针特异性识别序列紧密结合，荧光探针无法与其特异性识别序列结合形成双链，因此处于单链卷曲状态，荧光基团与淬灭基团靠近，无荧光信号产生。
11、当进行pcr扩增时，发夹引物(f)通过靶基因特异性识别序列结合靶dna模板，启动延伸；经过一轮扩增之后，反向引物(r)以发夹引物(f)启动延伸的产物为模板进行扩增，当延伸至发夹结构5’端时，taq dna聚合酶的5’→3’外切酶启动切割活性，使其继续延伸至延伸阻滞基团处停止延伸；第三轮扩增时，发夹引物(f)以反向引物(r)的扩增产物为模板进行扩增，此时由于模板含有发夹引物的连接序列的反向互补序列，使得发夹引物(f)的连接序列随同靶基因特异性识别序列优先与模板结合，游离出荧光探针特异性识别序列；之后，荧光探针与游离出的荧光探针特异性识别序列结合形成双链，此时荧光探针的荧光基团与淬灭基团远离发出荧光。
12、通过实时监测荧光信号产生扩增曲线，扩增之后直接进行熔解曲线分析。通过设定不同的连接序列(改变荧光探针与连接序列的匹配程度)，即可产生多个不同的tm值，实现多重检测。
13、一种用于荧光定量pcr检测的引物，所述引物即为发夹引物，其序列包括从5’到3’方向依次连接的15bp～45bp的荧光探针特异性识别序列、3bp～30bp的环部序列、15bp～45bp的连接序列和15bp～30bp的靶基因特异性识别序列；
14、所述荧光探针特异性识别序列(即top strand)包含与荧光探针靶向结合的序列，所述荧光探针用于与所述引物联用进行荧光定量pcr检测；
15、所述环部序列(即loop)为无关序列，其3’末端设有延伸阻滞基团，所述无关序列与荧光定量pcr检测所用的荧光探针序列和待测靶基因的序列均无关；
16、所述连接序列(bottom strand)包含与所述荧光探针特异性识别序列反向互补配对的序列；
17、所述靶基因特异性识别序列包含靶向结合待测靶基因的序列，即按照常规的引物设计方法针对待测靶基因的序列设计得到的荧光定量pcr引物的序列，用于靶向结合靶标序列。
18、优选地，所述荧光探针特异性识别序列的长度为20bp～30bp。
19、更优选地，所述荧光探针特异性识别序列的长度与所述荧光探针的序列长度相同。
20、进一步优选地，所述荧光探针特异性识别序列的长度为27bp或30bp。
21、优选地，所述环部序列的长度为4bp～10bp。
22、更优选地，所述环部序列的长度为5bp。
23、进一步优选地，所述环部序列的碱基全部相同，即为aaaaa、ttttt、ccccc或ggggg。
24、更进一步优选地，所述环部序列为aaaaa。
25、优选地，所述连接序列的长度为20bp～30bp。
26、更优选地，所述连接序列的长度与所述荧光探针特异性识别序列的长度相同。
27、进一步优选地，所述连接序列的长度为27bp或30bp。
28、优选地，所述靶基因特异性识别序列的长度为18bp～22bp。
29、本专利技术对所述延伸阻滞基团的种类没有特殊限定，包括但不限于c3 spacer、c6spacer、dspacer、inverted da等具有延伸阻滞作用的延伸阻滞基团均能实现本专利技术的目的。因延伸阻滞基团的修饰性能和适配碱基的需求，适应性调整或优化被修饰碱基的种类，也能实现本专利技术的目的。
30、优选地，所述环部序列的3’末端设有的延伸阻滞基团为c3 spacer。
31、具体地，检测tp53基因的所述引物的核苷酸序列如seq id no.本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于荧光定量PCR检测的引物，其特征在于，所述引物的序列包括从5’到3’方向依次连接的15bp～45bp的荧光探针特异性识别序列、3bp～30bp的环部序列、15bp～45bp的连接序列和15bp～30bp的靶基因特异性识别序列；
2.权利要求1所述引物在单重和/或多重荧光定量PCR检测中的应用。
3.一种用于多重荧光定量PCR检测的引物探针组合物，其特征在于，包含检测不同待测靶基因的引物对和一个通用荧光探针；
4.根据权利要求3所述的引物探针组合物，其特征在于，所述各引物对的正向引物为所述Tm值不同的权利要求1所述引物。
5.根据权利要求4所述的引物探针组合物，其特征在于，所述荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.22所示。
6.根据权利要求5所述的引物探针组合物，其特征在于，所述荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，则所述正向引物中，所述荧光探针特异性识别序列包含核苷酸序列如SEQ ID NO.23～26任一所示的序列。
7.根据权利要求5所述的引物探针组合
8.权利要求3～7任一所述引物探针组合物的在多重荧光定量PCR检测中的应用。
9.一种用于多重荧光定量PCR检测的组合物，其特征在于，包含DNA聚合酶和权利要求3～7任一所述的引物探针组合物。
10.一种同步检测多个靶基因的多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：以待测样本的核酸为模板，使用权利要求9所述的组合物进行PCR扩增，所述PCR扩增的程序包括扩增和熔解两个阶段，根据所得熔解曲线进行分析。
...【技术特征摘要】
1.一种用于荧光定量pcr检测的引物，其特征在于，所述引物的序列包括从5’到3’方向依次连接的15bp～45bp的荧光探针特异性识别序列、3bp～30bp的环部序列、15bp～45bp的连接序列和15bp～30bp的靶基因特异性识别序列；
2.权利要求1所述引物在单重和/或多重荧光定量pcr检测中的应用。
3.一种用于多重荧光定量pcr检测的引物探针组合物，其特征在于，包含检测不同待测靶基因的引物对和一个通用荧光探针；
4.根据权利要求3所述的引物探针组合物，其特征在于，所述各引物对的正向引物为所述tm值不同的权利要求1所述引物。
5.根据权利要求4所述的引物探针组合物，其特征在于，所述荧光探针的核苷酸序列如seq id no.9或seq id no.22所示。
6.根据权利要求5所述的引物探针组合物，其特征在于，所述荧光探针的核苷酸序列如s...
【专利技术属性】
技术研发人员：许明炎，周仲春，张晓妮，沈焕明，
申请(专利权)人：深圳海普洛斯医学检验实验室，
类型：发明
国别省市：
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