【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及核酸提取，具体地，涉及一种特异性富集人源总核酸的细胞裂解液及其应用。
技术介绍
1、分子诊断技术是指以dna和rna为诊断材料，用分子生物学技术通过检测基因的存在、缺陷或表达异常，从而对人体状态和疾病做出诊断的技术，广泛应用于基因组研究、转录组研究、外泌体、表观遗传学研究等，目前大部分人源样本核酸提取方法未将人及人体微生物分离。ron sender等人统计，人体内细菌的数量几乎与人体细胞的数量相同，约3×1013个，且存在于多个器官中。
2、泌尿系统早筛中，尿液检测是一种重要的非侵入性检测方法，通过取包含尿液全部细胞的尿沉渣并对泌尿系统脱落细胞进行dna突变和甲基化检测等。如el azzouzi等通过探索尿沉渣作为膀胱癌dna甲基化检测的非侵入性方法，通过尿液脱落细胞的dna甲基化状态评估膀胱癌发生进程；而尿路系统感染导致尿液中存在大量微生物，对早筛检测结果产生干扰，另一方面，通过ngs方法检测全基因组，也将引入大量的非人源信息，造成数据浪费，进一步提高了测序成本。
3、除了泌尿系统癌症外，消化道癌症早筛也是癌症重要研究方向，而消化道癌症早筛依赖肠镜，早期患者检测意愿不高，易被忽视，80％的患者中晚期才被确诊，因此一种有效的早期检测方式至关重要。粪便是一种经过肠等消化道形成的排泄产物，肠道肿瘤细胞脱落后随粪便排出，检测粪便上皮细胞中是否存在肿瘤特异性分子，可以作为肠癌早筛的检测方法。但粪便中的上皮脱落细胞含量极少，一般来说，粪便中人上皮细胞占比在10％以下，剩余基本为代谢废物及食物残渣，其中
4、在恶性肿瘤诊断中，通过肺泡灌洗获取肺部支气管上皮细胞中的肿瘤细胞，对活检困难的周围型肺癌具有较好的诊断效果，通过检测肿瘤细胞分子分型，用于伴随诊断指导药物治疗。而同时患有微生物感染的患者，肺泡灌洗液中存在着大量的微生物，包含大量的微生物基因组，干扰对肿瘤分子(即人源基因)的检测，造成检测灵敏度下降。另外，在血液、唾液等存在微生物的人类体液中，必要时能够通过富集人源核酸，提高分子检测的准确性。
5、现有技术表明，在rna层面，mirna在机体内分布广泛，能够在血液、尿液、母乳、眼泪、支气管灌洗液、精浆和胸膜液等样本中被检测到，而mirna不仅能够用于肿瘤筛查，也可用于肿瘤病情的监测、疗效评估和预后判断。人外泌体rna测序容易受到微生物rna的干扰，导致在分析中存在大量无用数据，在进行小rna分型及转录本分析时易产生干扰，在生信分析过滤时易将有效数据误过滤，提高了分析难度，增加了额外测序成本，因此有必要富集人源核酸，提高总体质量。
6、现有技术(具有去除宿主基因组dna功能的微生物核酸提取方法以及试剂盒)公开了捕获宿主基因mir家族基因和alu家族基因的引物组，但其探针合成成本高且实验流程相对复杂，而且探针捕获只能捕获部分的人源基因组dna，对于rna等核酸无法特异性捕获；现有技术(从粪便中提取富集人源dna的方法)利用所述包含n条针对目标人源dna的捕获探针对人源dna进行捕获，但同样无法富集rna等遗传物质，且需开展捕获实验，流程相对复杂，并且由于捕获dna的效率不可能是100％，该方法可能出现丢靶现象；而目前的主要分离方法中，梯度离心法可以分离不同类型的细胞，已达到富集的目的，但该方法依赖于细胞密度及细胞大小，宿主细胞以及微生物细胞之间无法完全分开，并且有文献(pmid：29482639)说明：利用梯度离心法分离微生物及宿主，以不分离作为对照，经过测序分析未发现人基因含量显著差异。
7、现有技术已经提供了大量资料及方法去指导如何从人源样本中富集微生物宏基因组，但从人源样本中去除微生物样本的研究却少之又少，主要集中在粪便样本中的微生物去除，且大部分方法需要额外加入外源序列(探针)，费时费力且无法实现很好同时富集人源dna和rna。
8、因此目前急需一种方法，在去除样本中微生物宏基因组干扰的情况下，能够实现同时富集人源dna和rna。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种用于特异性富集人源总核酸的细胞裂解液及其应用。
2、本专利技术的第一目的是提供一种特异性富集人源总核酸的细胞裂解液。
3、本专利技术的第二目的是提供上述细胞裂解液在特异性富集样本中人源总核酸中的应用。
4、本专利技术的第三目的是提供一种特异性富集待提取样本中人源总核酸的方法。
5、为了实现上述目的，本专利技术是通过以下方案予以实现的：
6、一种特异性富集人源总核酸的细胞裂解液，以终浓度计，含有0.1g/100ml～0.45g/100ml的氯化钠、0.5～1.5mm的二硫苏糖醇(dtt)、ph为6.5～8，浓度为1～10mm的pbs、1～10mm的乙二胺四乙酸(edta)和体积浓度为0.1～1％的triton x-100。
7、优选地，以终浓度计，含有0.2g/100ml～0.4g/100ml的氯化钠、0.8～1mm的二硫苏糖醇、ph为6.8～7.4，浓度为10mm的pbs、1～5mm的乙二胺四乙酸和体积浓度为0.1～0.5％的triton x-100。
8、更优选地，以终浓度计，含有0.4g/100ml的氯化钠、0.8mm的二硫苏糖醇、ph为6.8，浓度为10mm的pbs、5mm的乙二胺四乙酸和体积浓度为0.2％的triton x-100。
9、进一步优选地，所述细胞裂解液的溶剂为水。
10、氯化钠(nacl)溶液能够使细胞内外产生渗透压，人源细胞吸水而涨破，而细菌和真菌等微生物具有细胞壁，在低渗环境中结构稳定性更强，控制nacl浓度即可达到破碎人细胞的目的；但单纯靠低渗破碎细胞效率较低，且细胞中的细胞核无法完整消化，无法有效得到人源总核酸。专利技术人意外地发现，使用上述比例组成的细胞裂解液能够在不破坏细菌和真菌结构的情况下(即不释放微生物来源的核酸)，富集到更多的人源总核酸。
11、因此，本专利技术还请求保护上述任一所述的细胞裂解液在特异性富集样本中人源总核酸中的应用。
12、一种特异性富集待提取样本中人源总核酸的方法，包括以下步骤：
13、s1.将上述任一所述的细胞裂解液与待提取样本按照体积比为2～5：1混合，并加入5～10u的rna酶蛋白抑制剂，得到裂解体系；
14、s2.向步骤s1得到的裂解体系中加入胰蛋白酶，充分裂解后，充分离心收集上清液即得人源总核酸；
15、所述胰蛋白酶在裂解体系中的终浓度为0.001～0.003g/ml。
16、优选地，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种特异性富集人源总核酸的细胞裂解液，其特征在于，以终浓度计，含有0.1g/100mL～0.45g/100mL的氯化钠、0.5～1.5mM的二硫苏糖醇、pH为6.5～8，浓度为1～10mM的PBS、1～10mM的乙二胺四乙酸和体积浓度为0.1～1％的Triton X-100。
2.根据权利要求1所述的细胞裂解液，其特征在于，以终浓度计，含有0.2g/100mL～0.4g/100mL的氯化钠、0.8～1mM的二硫苏糖醇、pH为6.8～7.4，浓度为10mM的PBS、1～5mM的乙二胺四乙酸和体积浓度为0.1～0.5％的Triton X-100。
3.根据权利要求2所述的细胞裂解液，其特征在于，以终浓度计，含有0.4g/100mL的氯化钠、0.8mM的二硫苏糖醇、pH为6.8，浓度为10mM的PBS、5mM的乙二胺四乙酸和体积浓度为0.2％的Triton X-100。
4.权利要求1～3任一所述的细胞裂解液在特异性富集样本中人源总核酸中的应用。
5.一种特异性富集待提取样本中人源总核酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，待提取样本为粪便样本，步骤S1中所述权利要求1～3任一所述的细胞裂解液与待提取样本的体积比为5：1；
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，待提取样本为粪便样本、血液样本和/或唾液样本，步骤S1中加入10U的RNA酶蛋白抑制剂；
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，待提取样本为粪便样本，步骤S2中所述胰蛋白酶在裂解体系中的终浓度为0.001g/mL；
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，待提取样本为粪便样本，步骤S2中所述充分裂解为裂解10min；
...【技术特征摘要】
1.一种特异性富集人源总核酸的细胞裂解液，其特征在于，以终浓度计，含有0.1g/100ml～0.45g/100ml的氯化钠、0.5～1.5mm的二硫苏糖醇、ph为6.5～8，浓度为1～10mm的pbs、1～10mm的乙二胺四乙酸和体积浓度为0.1～1％的triton x-100。
2.根据权利要求1所述的细胞裂解液，其特征在于，以终浓度计，含有0.2g/100ml～0.4g/100ml的氯化钠、0.8～1mm的二硫苏糖醇、ph为6.8～7.4，浓度为10mm的pbs、1～5mm的乙二胺四乙酸和体积浓度为0.1～0.5％的triton x-100。
3.根据权利要求2所述的细胞裂解液，其特征在于，以终浓度计，含有0.4g/100ml的氯化钠、0.8mm的二硫苏糖醇、ph为6.8，浓度为10mm的pbs、5mm的乙二胺四乙酸和体积浓度为0.2％的triton x-100。
<...【专利技术属性】
技术研发人员：许明炎，张晓妮，周书雄，林郁松，宋达，
申请(专利权)人：深圳海普洛斯医学检验实验室，
类型：发明
国别省市：
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