一种用于提高PCR反应特异性的捕获探针及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于提高PCR反应特异性的捕获探针，所述捕获探针为在捕获序列的5

【技术实现步骤摘要】
一种用于提高PCR反应特异性的捕获探针及其应用


[0001]本专利技术涉及基因检测
，具体地，涉及一种用于PCR反应特异性的捕获探针及其应用。

技术介绍

[0002]分子检测是一种灵敏度非常高的方法，分子检测方法主要可以分为PCR检测和测序两大类。其中PCR技术包括一代常规PCR技术、二代荧光PCR技术以及目前处于高速发展期的三代数字PCR技术。随着技术的发展与成熟，PCR技术已经被广泛应用于血筛、传染病、性病、遗传性疾病、肿瘤伴随诊断等检测场景。
[0003]PCR技术因其简单、快速、高效和成本低等优势，已经成为当下分子检测不可或缺的一种检测方法，但同时PCR检测的缺点也非常明显，即在灵敏度非常高的情况下，检测结果容易出现“假阳性”，尤其是在染料法定性的PCR扩增中更加严重，究其原因具体为：探针灵敏度高，与目标区域结合的能力非常强，同时探针与目标区域序列相似的非目标区域的结合能力也会假期，如果人工探针与非目的靶标片段发生结合并发数扩增，在足够多的扩增循环数里，错误的产物也会进行指数级别增长，最终造成错误的“阳性”判断。值得一提的是，几乎所有的PCR检测方法在足够多的循环数下都会产生非特异性扩增。
[0004]通常，解决特异性不足的方法是，在引物设计时选取靶标区域中与其他基因有差异性的序列段，根据具差异性序列段去设计差异化引物，但是在实际设计中，还需要考量适合PCR实验条件的引物，如引物退火温度、引物碱基比例、引物序列长度等，这些因素的调整与变化都可能会对PCR扩增效率、实验结果造成影响。这些综合的限制因素叠加，导致在一段相对固定的且有限的靶标序列范围内，设计人员不可避免地只能做有限的差异化。
[0005]常规的探针捕获技术通过设计捕获探针与目标基因组结合后扩增得到目标序列，但是在基因组较完整的情况下，用探针捕获目的基因组也是较完整的超长基因组，无法达到针对性富集位点的作用，基因检测特异性存在一定不足。
[0006]因此，在引物开发阶段的测试中，专业人员往往对引物特异性会着重关注；如何提高特异性，已经成为PCR检测方法的一个技术性问题。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种提高PCR反应特异性的捕获探针及其应用。
[0008]本专利技术的第一目的是提供一种用于提高PCR反应特异性的捕获探针。
[0009]本专利技术的第二目的是提供一种提高PCR特异性的方法。
[0010]本专利技术的第三目的是提供上述捕获探针和/或上述方法在减少基因检测中假阳性扩增中的应用。
[0011]为了实现上述目的，本专利技术是通过以下方案予以实现的：
[0012]一种用于提高PCR反应特异性的捕获探针，所述捕获探针为在捕获序列的5
’
端设
置有固相颗粒；所述固相颗粒通过化学基团与捕获序列连接；所述固相颗粒表面带有修饰基团，所述修饰基团与捕获序列形成稳定化学基团。
[0013]所述捕获探针应用于PCR技术基因检测时(包括一代常规PCR技术、二代荧光PCR技术以及三代数字PCR技术)，均能得到仅含目的基因的干净片段产物(无潜在的非特异性基因组模板)，进而降低非特异性扩增和假阳性扩增，以提高基因检测特异性。
[0014]优选地，所述基因检测为碱基不平衡区域和/或高同源区域的基因检测。
[0015]优选地，所述捕获序列基于待检测目的区域设计；所述捕获探针的捕获位置位于检测位点上游的1～200bp。
[0016]优选地，所述捕获序列的5
’
端修饰有氨基。
[0017]优选地，所述固相载体能够被固液分离，当固相载体与液体混合，能够通过固液分离将其从液体中分离。
[0018]更优选地，所述固相颗粒为磁性微球。
[0019]优选地，所述修饰基团为羧基修饰。
[0020]优选地，所述化学基团为固相颗粒表面的羧基修饰与捕获序列5
’
端的氨基形成的酰胺键。
[0021]一种提高PCR特异性的方法，包括以下步骤：
[0022]S1.将权利要求1所述捕获探针和待检测样本的核酸按照0.05～0.5μM：1～500ng混合进行退火延伸，得到退火延伸反应液；
[0023]S2.对步骤S1得到的退火延伸反应液进行沉淀，固液分离后收集沉淀；
[0024]S3.用Tris
‑
HCl缓冲液对步骤S2得到的沉淀进行洗涤，得到洗涤后沉淀；
[0025]S4.去除洗涤后沉淀中的液体后与无核酸酶水混合，充分混匀后得到产物溶液，以产物溶液作为模板进行PCR扩增；
[0026]其中，步骤S1得到的退火延伸反应液、步骤S3的Tris
‑
HCl缓冲液和步骤S4的无核酸酶水之间的体积比为5：10～100：1～50。
[0027]优选地，所述基因检测为碱基不平衡区域和/或高同源区域的基因检测。
[0028]优选地，步骤S1中所述上述得到的捕获探针和待检测的核酸的比例为0.2μM：1～500ng。
[0029]优选地，步骤S2中所述进行沉淀具体为：利用变性剂对步骤S1得到的退火延伸反应液进行沉淀；
[0030]所述变性剂为0.1～0.2M的氢氧化钠和/或氢氧化钾溶液。
[0031]更优选地，所述变性剂为0.2M的氢氧化钠溶液。
[0032]更优选地，所述步骤S1得到的退火延伸反应液和变性剂的体积比为5：1～5。
[0033]进一步优选地，所述步骤S1得到的退火延伸反应液和变性剂的体积比为1：5。
[0034]优选地，步骤S3中所述Tris
‑
HCl缓冲液为pH 8.0的Tris
‑
HCl缓冲液。
[0035]优选地，步骤S1得到的退火延伸反应液、步骤S3的Tris
‑
HCl缓冲液和步骤S4的无核酸酶水之间的体积比为5：50：3。
[0036]本专利技术还请求保护上述任一所述的捕获探针和/或任一所述的方法在减少基因检测中假阳性扩增中的应用。
[0037]优选地，所述基因检测为碱基不平衡区域和/或高同源区域的基因检测。
[0038]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0039]本专利技术提供了一种用于提高PCR反应特异性的捕获探针，所述捕获探针为在捕获序列的5
’
端设置有固相颗粒；所述固相颗粒通过化学基团与捕获序列连接；所述固相颗粒表面带有修饰基团，修饰基团与捕获序列形成稳定化学基团。利用该捕获探针进行基因特异性检测，通过对待检测核酸样本中的基因组预处理，去除潜在可能影响扩增特异性的污染基因组，得到仅含目的基因的干净片段产物(仅含靶标序列，无潜在的非特异性基因组模板)，将该干净片段产物作为模板进行PCR和/或基因测序等下游检测实验，减少非特异性扩增和假阳性扩增，提高碱基不平衡区域和/或高同源区域基因检测特异性。
附图说明
[0040本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于提高PCR反应特异性的捕获探针，其特征在于，所述捕获探针为在捕获序列的5
’
端设置有固相颗粒；所述固相颗粒通过化学基团与捕获序列连接；所述固相颗粒表面带有修饰基团，所述修饰基团与捕获序列形成稳定化学基团。2.根据权利要求1所述的捕获探针，其特征在于，所述固相颗粒为磁性微球。3.一种提高PCR特异性的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.将权利要求1所述捕获探针和待检测样本的核酸按照0.05～0.5μM：1～500ng混合进行退火延伸，得到退火延伸反应液；S2.对步骤S1得到的退火延伸反应液进行沉淀，固液分离后收集沉淀；S3.用Tris
‑
HCl缓冲液对步骤S2得到的沉淀进行洗涤，得到洗涤后沉淀；S4.去除洗涤后沉淀中的液体后与无核酸酶水混合，充分混匀后得到产物溶液，以产物溶液作为模板进行PCR扩增；其中，步骤S1得到的退火延伸反应液、步骤S3的Tris
‑
HCl缓冲液和步骤S4的无核酸酶水之间的体积比为5：10～...

【专利技术属性】
技术研发人员：许明炎，张晓妮，周书雄，
申请(专利权)人：深圳海普洛斯医学检验实验室，
类型：发明
国别省市：