【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因组学，具体为一种基于一代测序技术的病原体检测方法。
技术介绍
1、病原体是指能够导致人类或动植物感染性疾病的生物，包括病毒、支原体、衣原体、细菌、真菌、原虫、寄生虫等微生物。病原体检测是临床诊断和防控感染性疾病的重要手段，需要快速、全面、准确地鉴别病原体的物种、型别、耐药性和毒力等。基于qpcr的分子生物学检测方法通过对核酸特异性序列的检测，可以在短时间内快速鉴别病原体的种类，型别、耐药基因等。但是，由于qpcr的分子探针需要已知靶标序列和有限的荧光通道，该方法仅适用于已知序列的病原体和少数突变组合的检测，而对于病原体基因突变导致的感染性疾病，qpcr方法则无法满足。
2、随着基因组学技术的发展，高通量测序技术(也称下一代测序技术，ngs)已经能够做到不依赖于传统的微生物培养，可直接对临床样本中的核酸进行高通量测序，然后与数据库进行比对，实现感染性疾病的溯源、检测、分型和耐药评估等多个方面。其中，基于ngs鉴别微生物的主要方法有两种，分别是宏基因组测序(metagenomic ngs，mngs)和靶向测序(targeted ngs，tngs)。mngs是对人体样本或特定环境样品中的总核酸(dna或rna)进行高通量测序，通过比对数据库，得到感染病原体的相关信息。tngs是通过超多重pcr的方式检测样本中已知病原微生物和耐药基因信息。但无论是mngs还是tngs，由于测序平台的通量过高，常常需要积攒样本一起进行实验，否则其成本难以接受，ngs方法的灵活性和成本均显著高于一代测序。
3、一代
4、因此，qpcr技术只能鉴定特定型别菌株；而且对新出现的菌株无法进行鉴定。ngs技术需累积样本，检测不灵活成本高。常规全基因组软件设计引物对全长进行引物覆盖，没有选择性，保守区也一起扩增，对病原体分型无任何价值还造成引物间相互干扰，如何能以最少扩增子区分特定型别的病原体序列，降低引物间的相互干扰，降低实验成本成为目前亟需解决的技术问题。
技术实现思路
1、(一)解决的技术问题
2、针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种基于一代测序技术的病原体检测方法，具体地说，是一种基于给定病原体参考序列群筛选可区分特定型别的测序引物的方法。本专利技术通过给定的新冠序列群，挑选出最少的能区分特定新冠型别的引物序列。
3、(二)技术方案
4、为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：一种基于一代测序技术的病原体检测方法，该方法具体步骤如下：
5、步骤s1：参考基因组确定；
6、步骤s2：菌株确定；
7、步骤s3：本地snp数据库构建；
8、步骤s4：引物设计；
9、步骤s5：测序验证。
10、优选的，如上步骤s1所述的参考基因组确定是以ncbi为参考基因组，ncbi的mn908947.3菌株序列为世界上第一个新型冠状病毒的全基因测序。
11、优选的，如上步骤s2所述的菌株确定是以50种菌株确定。
12、优选的，所述的50种菌株选择原则主要包含流行率、并覆盖阿尔法(alpha)、贝塔(beta)、德尔塔(delta)和奥秘克绒(omicron)菌株，进行基因组下载。
13、优选的，如上步骤s3所述的本地snp数据库构建是对50种菌株和参考基因组进行比对，比对主要采用全局比对、后缀树算法，后缀树数据结构的全基因组比对方法，利用后缀树的数据结构有效地将算法的时间和空间复杂度由(n3)降到了(n)，得到本地snp数据库。
14、优选的，如上步骤s4所述的引物设计是使用在线软件overlapping primersets(http://pcrsuite.cse.ucsc.edu/overlapping_primers.html)进行引物设计，参考序列是ncbi的mn908947.3菌株序列，软件进行叠瓦式设计，扩增子覆盖基因组全长，引物设计参数同时考虑引物的tm值和范围，gc含量，引物长度等因素。
15、优选的，如上步骤s5所述的测序验证包括以下步骤：
16、步骤s51：使用设计的筛选后的引物群对样本进行pcr扩增，然后进行sanger测序；
17、步骤s52：测序得到的序列和参考序列进行比对，然后和本地数据库进行比对，得到具体菌种信息。
18、(三)有益效果
19、本专利技术提供了一种基于一代测序技术的病原体检测方法。具备以下有益效果：本专利技术采用sanger测序，快速精确的snp位点定位方法，进行新型冠状病毒50种菌株鉴定。本方法不仅可以用于新型冠状病毒的菌株鉴定，也可以用来进行别的相似特定型别物种菌株鉴定。
20、本专利技术提供了一种基于一代测序技术的病原体检测方法。具备以下有益效果：通过快速、低成本的方法不仅可以进行新型冠状病毒常见特定型菌株鉴定，而且可以进行其余相似物种特定型别的鉴定，该方法能够有效地筛选出适用于测序中需要扩增多个目标序列的引物，提高引物的特异性和灵敏度，从而提高病原体检测的效率、准确性和可靠性。
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1.一种基于一代测序技术的病原体检测方法，其特征在于：该方法具体步骤如下：
2.根据权利要求1所述的一种基于一代测序技术的病原体检测方法，其特征在于：如上步骤S1所述的参考基因组确定是以NCBI为参考基因组，NCBI的MN908947.3菌株序列为世界上第一个新型冠状病毒的全基因测序。
3.根据权利要求1所述的一种基于一代测序技术的病原体检测方法，其特征在于：如上步骤S2所述的菌株确定是以50种菌株确定。
4.根据权利要求3所述的一种基于一代测序技术的病原体检测方法，其特征在于：所述的50种菌株选择原则主要包含流行率、并覆盖阿尔法(Alpha)、贝塔(Beta)、德尔塔(Delta)和奥秘克绒(Omicron)菌株，进行基因组下载。
5.根据权利要求1所述的一种基于一代测序技术的病原体检测方法，其特征在于：如上步骤S3所述的本地snp数据库构建是对50种菌株和参考基因组进行比对，比对主要采用全局比对、后缀树算法，后缀树数据结构的全基因组比对方法，利用后缀树的数据结构有效地将算法的时间和空间复杂度由(N3)降到了(N)，得到本地snp
6.根据权利要求1所述的一种基于一代测序技术的病原体检测方法，其特征在于：如上步骤S4所述的引物设计是使用在线软件Overlapping Primersets进行引物设计，参考序列是NCBI的MN908947.3菌株序列，软件进行叠瓦式设计，扩增子覆盖基因组全长，引物设计参数同时考虑引物的Tm值和Tm值可调范围，GC含量，引物长度等因素。
7.根据权利要求1所述的一种基于一代测序技术的病原体检测方法，其特征在于：如上步骤S5所述的测序验证包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种基于一代测序技术的病原体检测方法，其特征在于：该方法具体步骤如下：
2.根据权利要求1所述的一种基于一代测序技术的病原体检测方法，其特征在于：如上步骤s1所述的参考基因组确定是以ncbi为参考基因组，ncbi的mn908947.3菌株序列为世界上第一个新型冠状病毒的全基因测序。
3.根据权利要求1所述的一种基于一代测序技术的病原体检测方法，其特征在于：如上步骤s2所述的菌株确定是以50种菌株确定。
4.根据权利要求3所述的一种基于一代测序技术的病原体检测方法，其特征在于：所述的50种菌株选择原则主要包含流行率、并覆盖阿尔法(alpha)、贝塔(beta)、德尔塔(delta)和奥秘克绒(omicron)菌株，进行基因组下载。
5.根据权利要求1所述的一种基于一代测序技术的病原体...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘志岩，郑青松，
申请(专利权)人：北京星云医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：
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