System.ArgumentOutOfRangeException: 索引和长度必须引用该字符串内的位置。 参数名: length 在 System.String.Substring(Int32 startIndex, Int32 length) 在 zhuanliShow.Bind()
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测领域,尤指一种细胞外囊泡自动化标记分离方法、装置及试剂盒。
技术介绍
1、细胞外囊泡(ev)是大多数细胞都会分泌的由磷脂双分子层包覆的囊泡。近年来,细胞外囊泡(ev)因其在生理、治疗和病理过程中的作用而受到了极大的关注。已知ev通过各种信号通路在功能上参与细胞间通讯,包括将货物(rna 和蛋白质)递送到受体细胞中。由于ev在它们的大小、货物、功能作用和起源细胞方面具有高度异质性,因此,ev的实时成像和跟踪对研究ev的吸收、ev 在生物体内的分布、ev与疾病的相互作用等方面至关重要。
2、目前ev的荧光标记主要包括以下几种方式:
3、基于ev表面特异性标志物的标志技术。四跨膜蛋白如cd9、cd63和cd81 在许多ev类型的表面上很丰富,并且被称为ev的常见标志物,可以通过在针对这些抗原的抗体上标记荧光染料,再将这些抗体与外泌体反应,从而完成标记过程。该方法可以特异性的标记特定的外泌体亚型,且荧光染料不一定要是脂溶性的;
4、ev的脂膜标记。由于外泌体是由磷脂双分子层包裹的囊泡,因此只有亲脂性染料可以非特异性的标记外泌体。常见的标记ev的亲脂性染料包括pkh系列、 dii/dir/did系列染料、fm染料等;
5、ev的腔内标记。ev的管腔可以使用膜渗透染料进行荧光标记,例如钙黄绿素的乙酰甲氧基衍生物(calceinam)和羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯 (cfda-se,以下简称cfse)。这些化合物在ev内部以其水解形式产生荧光且不再渗透ev,从而完成对外泌体
6、现有的ev荧光标记主要依靠基于ev表面的特异性标志物标记荧光或通过脂溶性染料标记荧光这两种方式。由于不同ev表面的特异性标志物是不一样的,目前还没有发现一种特异性标志物是ev所独有的,这就使得基于ev表面的特异性标志物标记荧光这种方式仅能标记一部分的ev亚型,使得很多不含有该标志物的ev被遗漏标记。
7、通过脂溶性染料标记荧光方式的话,由于ev是生物来源的,来源于血液、组织液、尿液等多种体液,这些体液是溶于水的。也就是说虽然ev含有亲脂的磷脂双分子层,但是由于ev存在的环境是水溶性的,这就导致脂溶性的荧光染料难以直接标记水环境中的ev。一般需要通过一些特殊反应液作为中间媒介才能实现脂溶性染料对水溶液中的ev的标记。但是这些作为中间媒介的反应液一方面可能会对下游的检测和分析造成干扰,另一方面在体内成像领域也会带来潜在的风险。
8、为了通过荧光标记对ev的吸收、生物分布和表征研究做出可靠的结论,需要一个标记后步骤来去除未结合的荧光染料。已采用不同的技术将标记的ev与未掺入的染料分开,主要包括差速离心法、密度梯度离心法、尺寸排阻色谱法、过滤法等。这些方法本质上是外泌体的分离方法,也就是为了得到荧光标记的外泌体至少需要对外泌体分离两次(外泌体样本制备一次,标记完外泌体后至少一次),这无疑是费时费力的;而且,外泌体的分离效率是有限的,哪怕是外泌体分离的金标准(差速离心法),对于外泌体的分离效率也就60%左右,这就使得经过两次外泌体分离后仅能得到小部分荧光标记外泌体。
9、现有的公开号为cn110560186a的使用微流控芯片合成生物膜纳米颗粒的方法及微流控芯片,还包括向生物膜道通入生物膜溶液,向聚合物通道通入含有聚合物的有机溶液,使有机溶液与生物膜溶液混合,混合后进入第一混合通道;向pbs通道中通入pbs溶液,使pbs溶液与混合溶液混合;混合后溶液输出至第二混合通道,以使混合溶液中的聚合物在压力和超声波作用下挤入生物膜内部。
10、上述实现方案中为了标记荧光,还需要将荧光分子与聚合物溶液和生物膜融合混合,这无疑会引入聚合物杂质,影响下游分析、带来潜在的生物安全性问题;此外,还需要加入有机溶剂,所述有机溶剂包括乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、三氟乙醇、甲醇和乙醇中的任一种,且反应完成后未将这些有机溶剂去除。这些有机溶剂明确是有生物毒性的,生物膜存在于这些有机溶剂中,限制了其在生物领域的应用。该实现方案不包含实现包裹纳米颗粒的生物膜与聚合物、有机试剂分离的技术,需要额外的分离过程分离标记完的ev。
11、目前,ev的荧光标记已被用于帮助研究人员在体外和体内识别和监测ev,无法实现自动化标记和自动化分离。
技术实现思路
1、本专利技术提供种双重液滴细胞外囊泡自动化标记分离方法、装置及试剂盒,解决现有的无法实现细胞外囊泡自动化标记分离的问题。
2、本专利技术提供的技术方案如下一种细胞外囊泡自动化标记分离方法,所述方法包含以下步骤:将含有待标记的细胞外囊泡的样本溶液,与不相溶的染料形成样本包裹染料的包裹液滴,再与油相形成油相包裹样本包裹染料的双重液滴;双重液滴中间相即待标记样本中的细胞外囊泡与双重液滴内相即染料液滴在两者的液面交界处进行标记;含有标记完染料的细胞外囊泡的样本相互融合,染料相互融合,密度不同的样本、油相、染料相互分层后以实现自动化分离。
3、在一个具体的实施方式中,所述油相与样本不相溶,所述油相与染料相溶或不相溶。
4、在一个具体的实施方式中,具体步骤包括:
5、将含有待标记的细胞外囊泡的样本沿输送单元输送,并在所述输送单元的输送通路上间隔且先后向输送单元中输入与样本中的溶液不相溶的染料及油相,使所述待测样本在与染料的交汇处形成样本包裹染料的包裹液滴;包裹液滴输送至与油相交汇处时,形成油相包裹液滴,以形成双重液滴;
6、双重液滴沿输送单元输送并汇集于标记单元处进行标记;在标记单元中,所述待测样本中的细胞外囊泡与双重液滴中的染料在样本与染料的液面交界处进行细胞外囊泡的标记;
7、标记后的样本相互融合、染料相互融合,以使密度不同的所述样本、油相、染料会相互分层;
8、收集标记后的所述样本。
9、在一个具体的实施方式中,所述样本的密度大于油相的密度,所述样本的密度大于染料的密度。
10、在一个具体的实施方式中,所述样本包括细胞外囊泡和细胞外囊泡所在的溶液。
11、在一个具体的实施方式中,所述样本中的溶液与所述油相不相溶,所述样本中的溶液与染料不相溶,所述油相与染料相溶或不相溶。
12、在一个具体的实施方式中,分离后的所述染料与所述油相相互融合。
13、在一个具体的实施方式中,所述油相包括油、液体石蜡、烷烃一种或几种组;所述染料为脂溶性染料且为细胞膜染料。
14、在一个具体的实施方式中,所述油相为矿物油、硅油、液体石蜡、以及含有5个碳原子以上的烷烃中的一种或几种组合;
15、所述染料包括pkh系列染料、claret染料、dii/dir/did系列染料、fm染料、钙黄绿素的乙酰甲氧基衍生物(calcein am)、羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(cfse)中的一种。
16、其中,pkh(paul karl horan)染料,是paul karl hor本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种细胞外囊泡自动化标记分离方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:将含有待标记的细胞外囊泡的样本溶液,与不相溶的染料形成样本包裹染料的包裹液滴,再与油相形成油相包裹样本包裹染料的双重液滴;双重液滴中间相即待标记样本中的细胞外囊泡与双重液滴内相即染料液滴在两者的液面交界处进行标记;含有标记完染料的细胞外囊泡的样本相互融合,染料相互融合,密度不同的样本、油相、染料相互分层后以实现自动分离。
2.根据权利要求1所述细胞外囊泡自动化标记分离方法,其特征在于,所述具体步骤为:所述油相与样本不相溶,所述油相与染料相溶或不相溶。
3.根据权利要求1所述细胞外囊泡自动化标记分离方法,其特征在于,所述具体步骤为:
4.根据权利要求1所述细胞外囊泡自动化标记分离方法,其特征在于:
5.根据权利要求1所述细胞外囊泡自动化标记分离方法,其特征在于:述样本包括细胞外囊泡和细胞外囊泡所在的溶液。
6.根据权利要求2所述的细胞外囊泡自动化标记分离方法,其特征在于:所述样本中的溶液与所述油相不相溶,所述样本中的溶液与染料不相溶,所述油相与染料相溶
7.根据权利要求6所述的细胞外囊泡自动化标记分离方法,其特征在于:分离后的所述染料与所述油相相互融合。
8.根据权利要求1所述的一种细胞外囊泡自动化标记分离方法,其特征在于:所述油相包括油、液体石蜡、烷烃一种或几种组合;
9.根据权利要求8所述的一种细胞外囊泡自动化标记分离方法,其特征在于:
10.根据权利要求1所述的一种细胞外囊泡自动化标记分离方法,其特征在于:所述样本、染料以及油相的流速可控,以调节所述双重液滴的大小。
11.根据权利要求1所述的一种细胞外囊泡自动化标记分离方法,其特征在于:所述双重液滴的直径为1-1000μm。
12.根据权利要求9所述的一种细胞外囊泡自动化标记分离方法,其特征在于:所述双重液滴的直径为10-100μm。
13.一种细胞外囊泡自动化标记分离装置,其特征在于,所述标记分离装置包括:
14.根据权利要求13一种细胞外囊泡自动化标记分离装置,其特征在于,所述标记单元与收集单元的底部相连通。
15.根据权利要求13或14所述的一种细胞外囊泡自动化标记分离装置,其特征在于:
16.一种双重液滴细胞外囊泡自动化标记分离试剂盒,其特征在于:标记分离试剂盒包括权利要求13-15的标记分离装置以及染料、油相。
...【技术特征摘要】
1.一种细胞外囊泡自动化标记分离方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:将含有待标记的细胞外囊泡的样本溶液,与不相溶的染料形成样本包裹染料的包裹液滴,再与油相形成油相包裹样本包裹染料的双重液滴;双重液滴中间相即待标记样本中的细胞外囊泡与双重液滴内相即染料液滴在两者的液面交界处进行标记;含有标记完染料的细胞外囊泡的样本相互融合,染料相互融合,密度不同的样本、油相、染料相互分层后以实现自动分离。
2.根据权利要求1所述细胞外囊泡自动化标记分离方法,其特征在于,所述具体步骤为:所述油相与样本不相溶,所述油相与染料相溶或不相溶。
3.根据权利要求1所述细胞外囊泡自动化标记分离方法,其特征在于,所述具体步骤为:
4.根据权利要求1所述细胞外囊泡自动化标记分离方法,其特征在于:
5.根据权利要求1所述细胞外囊泡自动化标记分离方法,其特征在于:述样本包括细胞外囊泡和细胞外囊泡所在的溶液。
6.根据权利要求2所述的细胞外囊泡自动化标记分离方法,其特征在于:所述样本中的溶液与所述油相不相溶,所述样本中的溶液与染料不相溶,所述油相与染料相溶或不相溶。
7.根据权利要求6所述的细胞外囊泡自动化标记分离方法,其特征在于:分...
【专利技术属性】
技术研发人员:盛滔,王秀娟,张亚楠,
申请(专利权)人:上海思路迪生物医学科技有限公司,
类型:发明
国别省市:
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。