【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种联合检测九种下呼吸道感染病原菌的pcr引物组及试剂盒及其应用。
技术介绍
1、下呼吸道感染(low respiratory tract infections，lrts)是常见的呼吸系统感染性疾病，其发病率居高不下造成较重的经济负担。2019年全球疾病负担数据提示，全球下呼吸道感染发病率为6295/10万，死亡率为34.3/10万，共造成249万人死亡和9720万伤残调整寿命年。下呼吸道感染的病原谱相对广泛，其中80％以上的病例经检测证实为细菌性感染。由于下呼吸道感染缺乏典型的症状和体征，相同的症状可能由不同的病原菌引起，也可能由几种病原菌混合感染引起，这就给病原菌的确定和患者的临床治疗增加了难度。因此，下呼吸道感染病原菌的准确和快速鉴定可以进行针对性治疗，提高诊疗效果，降低医疗负担，有效减少抗菌药物的使用。
2、目前下呼吸道感染的常见实验室检测方法包括：培养法、血清学方法和分子生物学方法。目前，培养法依然是病原菌鉴定的“金标准”。然而，该方法检测周期长，操作复杂，敏感性低，且易受使用抗菌药物的影响出现假阴性，造成漏诊甚至误诊，延误或者错失治疗最佳时机。血清学方法主要基于抗原抗体反应的原理进行检测，检测周期短，但敏感性和特异性低。
3、近年来，荧光定量pcr技术已成为病原早期快速诊断的重要分子生物学方法。尽管具有高特异性、敏感性和时效性，但也存在如下问题：(1)检测靶标通量低：受限于荧光通道，单管能检测病原菌种类有限；(2)成本高：多种病原菌同时检测，成本较高。因此，提供一种
技术实现思路
1、针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种联合检测九种下呼吸道感染病原菌的pcr引物组及试剂盒及其应用。本专利技术的引物组和试剂盒利用多重pcr与毛细管片段分析法相结合，可以实现单管检测九种下呼吸道感染病原菌，该方法操作简单、检测准确、通量高、灵敏度高、特异性高，显著缩短检测时间可以实现2-3小时内出检测结果。
2、为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供一种联合检测九种下呼吸道感染病原菌的pcr引物组，所述引物组包括：金黄色葡萄球菌检测引物对、铜绿假单胞菌检测引物对、肺炎克雷伯菌检测引物对、大肠埃希菌检测引物对、肺炎链球菌检测引物对、流感嗜血杆菌检测引物对、嗜麦芽窄食单胞菌检测引物对、鲍曼不动杆菌检测引物对和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测引物对。
4、优选地，所述金黄色葡萄球菌检测引物对：包括核苷酸序列如seq id no.1所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no.2所示的下游引物。
5、优选地，所述铜绿假单胞菌检测引物对：包括核苷酸序列如seq id no.3所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no.4所示的下游引物。
6、优选地，所述肺炎克雷伯菌检测引物对：包括核苷酸序列如seq id no.5所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no.6所示的下游引物。
7、优选地，所述大肠埃希菌检测引物对：包括核苷酸序列如seq id no.7所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no.8所示的下游引物。
8、优选地，所述肺炎链球菌检测引物对：包括核苷酸序列如seq id no.9所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no.10所示的下游引物。
9、优选地，所述流感嗜血杆菌检测引物对：包括核苷酸序列如seq id no.11所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no.12所示的下游引物。
10、优选地，所述嗜麦芽窄食单胞菌检测引物对：包括核苷酸序列如seq id no.13所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no.14所示的下游引物。
11、优选地，所述鲍曼不动杆菌检测引物对：包括核苷酸序列如seq id no.15所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no.16所示的下游引物。
12、优选地，所述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测引物对：包括核苷酸序列如seq idno.17所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no.18所示的下游引物。
13、优选地，所述pcr引物组还包括内参扩增引物对。
14、优选地，所述内参扩增引物对：包括核苷酸序列如seq id no.19所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no.20所示的下游引物。
15、本专利技术中，对于上述的引物对的具有具体碱基序列而言，只要能够在pcr实施条件下特异性地识别各自的特异性识别区域(优选在单一的反应容器内使用的引物之间不发生退火及自退火)，则可以使1个或多个碱基替换为其他碱基，也可在3’端或5’端添加1个或多个碱基。此处，所谓多个，例如为2-3个。向引物添加1个或多个碱基的情况下，优选向引物的5’端添加。
16、本专利技术中，将上述的引物对具体的碱基序列中的1个或多个碱基取代为其他碱基而得到的碱基序列、与被取代前的碱基序列(即，序列号所示碱基序列)的同一性优选为70％以上，更优选为75％以上，更优选为80％以上，更优选为85％以上，更优选为90％以上，更优选为95％以上均可。
17、本专利技术中，对于各引物的长度而言，只要能够特异性地识别对应的特异性识别区域、且引物之间不发生杂交即可，没有特别限制，优选为15个碱基以上且40个碱基以下。更优选的，引物的长度的下限为16个碱基以上，进一步优选为17个碱基以上，进一步优选为18个碱基以上。更优选的是，引物的长度的上限为39个碱基以下，进一步优选为38个碱基以下，进一步优选为37个碱基以下。
18、本专利技术中，各检测引物对可单独包装，也可以混合配成多重pcr混合液。所述多重pcr混合液中，上述各引物对的量采用本领域技术人员所知悉的常规用量即可。
19、第二方面，本专利技术提供第一方面所述的联合检测九种下呼吸道感染病原菌的pcr引物组在制备检测金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、鲍曼不动杆菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中任意一种或至少两种的组合的试剂盒中的用途。
20、进一步的，所述用途为在制备联合检测金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、鲍曼不动杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的试剂盒中的用途。
21、更进一步的，所述用途为在制备联合检测下呼吸道感染中金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、鲍曼不动杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的试剂盒中的用途。
22、第三方面，本专利技术提供一种联合检测九种下呼吸道感染病原菌的试剂盒，所述试剂盒中包括多重pcr反应液和混合酶液，所述多重pcr反应液中含有第一方本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种联合检测九种下呼吸道感染病原菌的PCR引物组，其特征在于，所述引物组包括：金黄色葡萄球菌检测引物对、铜绿假单胞菌检测引物对、肺炎克雷伯菌检测引物对、大肠埃希菌检测引物对、肺炎链球菌检测引物对、流感嗜血杆菌检测引物对、嗜麦芽窄食单胞菌检测引物对、鲍曼不动杆菌检测引物对和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测引物对。
2.根据权利要求1所述的联合检测九种下呼吸道感染病原菌的PCR引物组，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物；
3.根据权利要求1或2所述的联合检测九种下呼吸道感染病原菌的PCR引物组，其特征在于，所述PCR引物组还包括内参扩增引物对；
4.权利要求1-3中任一项所述的联合检测九种下呼吸道感染病原菌的PCR引物组在制备检测金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、鲍曼不动杆菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中任意一种或至少两种的组合的试剂盒中的用途。
5.一种联合检测九
6.根据权利要求5所述的联合检测九种下呼吸道感染病原菌的试剂盒，其特征在于，所述混合酶液中包括UDG酶或UNG酶，和Multiplex DNA聚合酶。
7.根据权利要求5或6所述的联合检测九种下呼吸道感染病原菌的试剂盒，其特征在于，所述多重PCR反应液中还包括Multiplex PCR缓冲液。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的联合检测九种下呼吸道感染病原菌的试剂盒，其特征在于，所述多重PCR反应液中，每条引物的浓度各自独立的为100-300nmol/L。
9.根据权利要求5-8中任一项所述的联合检测九种下呼吸道感染病原菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括阳性质控品和/或阴性质控品；
10.根据权利要求5-9中任一项所述的联合检测九种下呼吸道感染病原菌的试剂盒，其特征在于，所述人DNA内参特异核酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。
...【技术特征摘要】
1.一种联合检测九种下呼吸道感染病原菌的pcr引物组，其特征在于，所述引物组包括：金黄色葡萄球菌检测引物对、铜绿假单胞菌检测引物对、肺炎克雷伯菌检测引物对、大肠埃希菌检测引物对、肺炎链球菌检测引物对、流感嗜血杆菌检测引物对、嗜麦芽窄食单胞菌检测引物对、鲍曼不动杆菌检测引物对和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测引物对。
2.根据权利要求1所述的联合检测九种下呼吸道感染病原菌的pcr引物组，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌检测引物对：包括核苷酸序列如seq id no.1所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no.2所示的下游引物；
3.根据权利要求1或2所述的联合检测九种下呼吸道感染病原菌的pcr引物组，其特征在于，所述pcr引物组还包括内参扩增引物对；
4.权利要求1-3中任一项所述的联合检测九种下呼吸道感染病原菌的pcr引物组在制备检测金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、鲍曼不动杆菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中任意一种或至少两种的组合的试剂盒中的用途。
5.一种联合检测九种下呼吸...
【专利技术属性】
技术研发人员：张祥林，张劲松，魏鹏，侯艳雯，陈晨，胡秋萍，黄华生，
申请(专利权)人：重庆巴斯德生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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