【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及一种重组酶辅助蛋白的atp酶活性检测方法、产品及应用。
技术介绍
1、重组酶聚合酶扩增技术通过模拟dna体内扩增，在等温条件下产生目的片段，该技术主要依赖重组酶uvsx、重组酶uvsy、单链结合蛋白gp32和链置换dna聚合酶bsu。重组酶uvsx能够不通过加热就解开双链dna。重组酶聚合酶扩增反应开始时，重组酶uvsx在atp的参与下结合引物，形成重组酶uvsx-引物复合体，这些复合体能够扫描与引物序列互补的目标双链dna。接着，核酸蛋白复合体侵入5'端位点形成d状环。单链结合蛋白gp32与被置换单链结合使其稳定。同时，重组酶uvsx离开寡核苷酸的3’端，降解后被dna聚合酶利用。之后，链置换dna聚合酶bsu结合在核酸蛋白复合体的游离3'端进行链延伸，形成新的互补链。重组酶聚合酶扩增技术中，重组酶uvsy可以改变重组酶uvsx-引物复合体解离及重新结合的可逆反应过程，使反应向更有利于rpa的进行。
2、t4 uvsy蛋白是rpa技术中的一种关键酶，在rpa中与t4 uvsx蛋白共同发挥作用，推动rpa反应的进行，检测t4 uvsy蛋白的活性的方法十分迫切。
3、uvsy辅酶来源于t4噬菌体，采用e.coli重组表达。该酶可促进t4 uvsx重组酶的依赖于dna的atpase的活性，包含atp结合位点和相互作用位点，降低其活性所需的uvsx临界浓度，从而促进链置换。因此对uvsy的atpase活性进行判断和定量有利于更好的指导和推动rpa技术在实际检验检测过程中的开发和应用。p>
技术实现思路
1、为了解决现有技术中存在的技术问题，本专利技术提供了以下技术方案：
2、本专利技术的第一方面提供了一种重组酶辅助蛋白的atp酶活性检测的体系，所述体系包括体积比例为反应buffer：vp2-r：ssb：atp：无酶水＝2.8:1:1:5:5.2。
3、进一步，所述反应buffer包括tris-hcl、kcl、mgcl2、dtt。
4、进一步，所述tris-hcl的ph值为7.9。
5、进一步，所述tris-hcl的浓度范围为100-150mm。
6、在一些实施方案中，所述tris-hcl的浓度范围包括100mm、105mm、110mm、115mm、120mm、125mm、130mm、135mm、140mm、145mm、150mm。
7、进一步，所述kcl的浓度范围为450-550mm。
8、在一些实施方案中，所述kcl的浓度范围包括450mm、460mm、470mm、480mm、490mm、500mm、510mm、520mm、530mm、540mm、550mm。
9、进一步，所述mgcl2的浓度范围为50-100mm。
10、在一些实施方案中，所述mgcl2的浓度范围包括50mm、55mm、60mm、65mm、70mm、75mm、80mm、85mm、90mm、95mm、100mm。
11、进一步，所述dtt的浓度范围为1-10mm。
12、在一些实施方案中，所述dtt的浓度范围包括1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm。
13、进一步，所述vp2-r的浓度范围为0-10μm。
14、在一些实施方案中，所述vp2-r的浓度范围包括0μm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm。
15、进一步，所述ssb的浓度范围为0-1mg/ml。
16、在一些实施方案中，所述ssb的浓度范围包括0mg/ml、0.005mg/ml、0.01mg/ml、0.015mg/ml、0.02mg/ml、0.025mg/ml、0.03mg/ml、0.035mg/ml、0.04mg/ml、0.045mg/ml、0.05mg/ml、0.055mg/ml、0.06mg/ml、0.065mg/ml、0.07mg/ml、0.075mg/ml、0.08mg/ml、0.085mg/ml、0.09mg/ml、0.095mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml、1.0mg/ml。
17、进一步，所述atp的浓度范围为0-10mm。
18、在一些实施方案中，所述atp的浓度范围包括1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm。
19、进一步，所述tris-hcl的浓度为120mm。
20、进一步，所述kcl的浓度为540mm。
21、进一步，所述mgcl2的浓度为60mm。
22、进一步，所述dtt的浓度为6mm。
23、进一步，所述vp2-r的浓度为2μm。
24、进一步，所述atp的浓度为5mm。
25、进一步，所述ssb的浓度为0.5mg/ml。
26、在一些实施方案中，所述vp2-r是指用于uvsy的atp酶活性检测的模板，所述vp2-r的具体序列为agtttgtatttcccatttgagttacaccacgtct。
27、本专利技术第二方面提供了一种重组酶辅助蛋白的atp酶活性检测的方法，所述方法包括如下步骤：
28、1)将本专利技术第一方面所述的体系配制完成后置于37℃恒温条件下孵育反应；
29、2)像步骤1)中反应完成的产物中添加重组酶和重组酶辅助蛋白，补充无酶水，得到第二反应体系继续置于37℃恒温条件下孵育反应；
30、3)步骤2)中反应完成的产物添加定磷剂，置于45℃恒温条件下孵育反应；
31、4)取步骤3)中反应完成的产物检测660nm处吸光值；
32、5)根据磷酸根离子浓度标准曲线与步骤4)中得到的吸光值，计算出uvsy的atp酶活性。
33、进一步，所述步骤1)中孵育反应的时间为15min。
34、进一步，所述步骤2)中孵育反应的时间为15min。
35、进一步，所述步骤1)中的体系、步骤2)中的重组酶、步骤2)中的重组酶辅助蛋白、步骤2)中的第二反应体系、步骤3)中的定磷剂的体积比为15:1:2:20:180。
36、进一步，所述定磷剂包括钼酸铵，抗坏血酸，硫酸，无酶水。
37、进一步，所述钼酸铵，抗坏血酸，硫酸，无酶水的体积比为0.3：1：1：2.7。
38、进一步，所述重组酶的来源包括噬菌体、原核生物、真核生物。
39、进一步，所述噬菌体包括t4、t6、rb69或aeh 1。
40、进一步，所述重组酶包括t4噬菌体的uvsx。
41、进一步，原核生物是大肠杆菌。
42、进一步，所本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组酶辅助蛋白的ATP酶活性检测的体系，其特征在于，所述体系包括体积比例为反应buffer：VP2-R：SSB：ATP：无酶水＝2.8:1:1:5:5.2。
2.根据权利要求1所述的体系，其特征在于，所述反应buffer包括Tris-HCl、KCl、MgCl2、DTT；
3.一种重组酶辅助蛋白的ATP酶活性检测的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中孵育反应的时间为15min；
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述磷酸根离子浓度标准曲线的构建包括如下步骤，使用权利要求1或2所述的反应buffer、KH2PO4标准溶液，以及无酶水组成磷酸根离子浓度标准曲线制备体系，置于37℃恒温条件下孵育反应；补充定磷剂，置于45℃恒温条件下孵育反应，测量660nm处吸光值，根据吸光值得到磷酸根离子浓度标准曲线；
6.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求3-5任一项所述的方法中使用的试剂；
7.权利要求1或2所述的体系，权利要求3-5任一项
8.权利要求1或2所述的体系，权利要求3-5任一项所述的方法在制备自动化检测重组酶辅助蛋白的ATP酶活性的系统或装置中的应用。
9.一种系统或装置，其特征在于，所述系统或装置包括处理模块，所述处理模块用于实施权利要求3-5任一项所述的方法；
10.一种重组酶辅助蛋白的ATP酶活性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的体系、权利要求3-5任一项所述的方法中使用的试剂、孵育容器及步骤说明书。
...【技术特征摘要】
1.一种重组酶辅助蛋白的atp酶活性检测的体系，其特征在于，所述体系包括体积比例为反应buffer：vp2-r：ssb：atp：无酶水＝2.8:1:1:5:5.2。
2.根据权利要求1所述的体系，其特征在于，所述反应buffer包括tris-hcl、kcl、mgcl2、dtt；
3.一种重组酶辅助蛋白的atp酶活性检测的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中孵育反应的时间为15min；
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述磷酸根离子浓度标准曲线的构建包括如下步骤，使用权利要求1或2所述的反应buffer、kh2po4标准溶液，以及无酶水组成磷酸根离子浓度标准曲线制备体系，置于37℃恒温条件下孵育反应；补充定磷剂，置于45℃恒...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈佳庆，魏瑞，梅斯尧，秦萍萍，张伦，刘霄卉，
申请(专利权)人：苏州东抗生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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