【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因重组疫苗，具体涉及一种猪细小病毒和流行性乙型脑炎二联亚单位疫苗制备方法及应用。
技术介绍
1、猪细小病毒病是由猪细小病毒(porcine parvovirus，ppv)感染而引起的病毒性传染病，该病主要引起母猪流产、产畸形胎及死胎，且可以通过胎盘屏障传播给仔猪；仔猪感染后会出现皮炎症、毒血症甚至死亡。流行性乙型脑炎病毒又名日本乙型脑炎(japaneseencephalitis virus，jev)，是一种蚊媒传播的人畜共患病毒，引起脑膜及脑组织发炎，会导致任娠母猪死胎、流产、木乃伊胎以及公猪的睾丸炎等。该病主要在蚊虫和猪之间传播，猪是其主要的贮存和增殖宿主。近年来，猪细小病毒病多与猪乙型性脑炎混合感染，给猪场造成较大的经济损失。目前市场有全病毒二联灭活疫苗用于预防猪细小病毒病和猪乙型脑炎病，但存在病毒灭活不彻底而带来的风险，且猪细小病毒在生产过程中易散毒而导致车间污染和其他产品污染，猪乙型脑炎也存在操作人员感染风险。因此开发有效的亚单位基因工程疫苗是趋势。表达的培养的病毒样颗粒(vlps)在形态和结构上与天然病毒相似，且不含核酸，具有良好的安全性和免疫原性。
2、专利cn112168959a公开了一种猪细小病毒与乙型脑炎二联亚单位疫苗，其虽然能同时预防猪细小病毒与乙型脑炎，但预防乙型脑炎的效果相对单苗没有提高，二联亚单位疫苗质量需进一步提高。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种免疫原组合物，它是由血凝效价比210～18：210～18的猪细小病
2、所述猪细小病毒vp2蛋白是seq id no.1所示核苷酸序列编码的蛋白；
3、所述猪乙型脑炎病毒preme蛋白是seq id no.2所示核苷酸序列编码的蛋白。
4、进一步地，所述猪细小病毒vp2蛋白和猪乙型脑炎病毒prme蛋白的血凝效价比210～14：210～14，优选210：210。
5、进一步地，所述猪细小病毒vp2蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示；所述猪乙型脑炎病毒preme蛋白的氨基酸序列如seq id no.4所示。
6、本专利技术还提供了一种前述免疫原组合物的制备方法，它包括以下步骤：
7、(1)分别取seq id no：1和seq id no：2所示核苷酸序列的基因片段，与表达载体连接，再导入大肠杆菌，提取重组杆粒，转染入昆虫细胞sf9中，培养，收集上清，得重组杆状病毒；
8、(2)分别取步骤2)所得重组杆状病毒，接种于昆虫细胞highfive，培养，收集猪细小病毒vp2蛋白和猪乙型脑炎病毒prme蛋白；
9、(3)按配比取步骤2)所得猪细小病毒vp2蛋白和猪乙型脑炎病毒prme蛋白，混合，即得。
10、进一步地，步骤(1)所述表达载体为pfastbacdual质粒；所述大肠杆菌为top10感受态细胞和/或dh10bac感受态细胞。
11、进一步地，步骤(2)所述培养至细胞活率低于10％。
12、本专利技术还提供了一种亚单位疫苗，它是以前述免疫原组合物为活性成分，加上免疫佐剂制成的疫苗。
13、进一步地，所述疫苗中猪细小病毒vp2蛋白的血凝效价为210～14，优选210；所述猪乙型脑炎病毒preme蛋白的血凝效价为210～14，优选210。
14、进一步地，所述免疫原组合物与佐剂的质量比为1～9：1。
15、更进一步地，所述免疫原组合物与佐剂的质量比为1：1。
16、更进一步地，所述佐剂包括15a佐剂、isa201佐剂或gel02佐剂，优选，isa201佐剂。
17、本专利技术通过对细小病毒vp2和乙脑病毒prme基因进行密码子序列优化，以特定基因序列表达的猪细小病毒vp2蛋白和猪乙型脑炎病毒prme蛋白为抗原，制成的二联亚单位疫苗，免疫效果良好，安全性高，经试验证明：将本专利技术制得的猪细小病毒vp2蛋白和猪乙型脑炎病毒prme蛋白，与isa201佐剂制备的亚单位疫苗，能使易感动物产生较高的ppv和jevhi抗体，免疫原性好，免疫效力均高于市售疫苗，具备实际推广应用价值。
18、显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
19、以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。
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1.一种免疫原组合物，其特征在于，它是由血凝效价比210～18：210～18的猪细小病毒VP2蛋白和猪乙型脑炎病毒prME蛋白组成；
2.根据权利要求1所述的免疫原组合物，其特征在于：所述猪细小病毒VP2蛋白和猪乙型脑炎病毒prME蛋白的血凝效价比210～14：210～14，优选210：210。
3.根据权利要求1所述的免疫原组合物，其特征在于：所述猪细小病毒VP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述猪乙型脑炎病毒preME蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.权利要求1～3任一项所述免疫原组合物的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述表达载体为pFastBacDual质粒；所述大肠杆菌为TOP10感受态细胞和/或DH10Bac感受态细胞。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述培养至细胞活率低于10％。
7.一种二联亚单位疫苗，其特征在于：它是以权利要求1所述免疫原组合物为活性成分，加上免疫佐剂制
8.根据权利要求6所述的亚单位疫苗，其特征在于：所述疫苗中猪细小病毒VP2蛋白的血凝效价为210～14，优选210；所述猪乙型脑炎病毒preME蛋白的血凝效价为210～14，优选210。
9.根据权利要求7所述的亚单位疫苗，其特征在于：所述免疫原组合物与佐剂的质量比为1～9：1，优选，质量比为1：1。
10.根据权利要求7～9任一项所述的亚单位疫苗，其特征在于：所述佐剂为15A佐剂、ISA201佐剂和/或Gel02佐剂，优选ISA201佐剂。
...【技术特征摘要】
1.一种免疫原组合物，其特征在于，它是由血凝效价比210～18：210～18的猪细小病毒vp2蛋白和猪乙型脑炎病毒prme蛋白组成；
2.根据权利要求1所述的免疫原组合物，其特征在于：所述猪细小病毒vp2蛋白和猪乙型脑炎病毒prme蛋白的血凝效价比210～14：210～14，优选210：210。
3.根据权利要求1所述的免疫原组合物，其特征在于：所述猪细小病毒vp2蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示；所述猪乙型脑炎病毒preme蛋白的氨基酸序列如seq id no.4所示。
4.权利要求1～3任一项所述免疫原组合物的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述表达载体为pfastbacdual质粒；所述大肠杆菌为top10...
【专利技术属性】
技术研发人员：张冬冬，林艳，郑琴勤，岳丰雄，刘汉平，陈莉群，夏嘉鑫，项聪英，
申请(专利权)人：成都史纪生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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