一种猪瘟E2蛋白基因、猪伪狂犬病毒gD蛋白基因及其应用制造技术

本发明专利技术涉及猪瘟E2蛋白基因、猪伪狂犬病毒gD蛋白基因及其应用。本发明专利技术将截去跨膜疏水区的猪瘟E2蛋白、伪狂犬gD蛋白基因重组构建至pCHO1.0质粒，并将重组后质粒通过脂质体转染，双加压筛选的方式成功构建了稳定表达猪瘟E2蛋白、及伪狂犬gD蛋白的CHO工程细胞系。该方法所构建的CHO工程细胞系表达的猪瘟E2蛋白、伪狂犬gD蛋白免疫原性好，表达产量高，免疫后便于临床血清与诊断及猪场猪瘟、伪狂犬病原的净化，可一针两防。具有较高的经济效益和市场前景。景。景。

【技术实现步骤摘要】
一种猪瘟E2蛋白基因、猪伪狂犬病毒gD蛋白基因及其应用


[0001]本专利技术属于基因重组疫苗
，具体涉及猪瘟E2蛋白基因、猪伪狂犬病毒gD蛋白基因及其应用。

技术介绍

[0002]猪瘟(classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)引起的一种高度接触性传染病，其主要特征是急性型以败血性变化为主，实质器官出血、坏死和梗死,慢性型则呈纤维素性坏死性肠炎变化。猪瘟是危害养猪业的主要传染病之一，世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。在《国家中长期动物疫病防治规划(2012—2020)》中，猪瘟也被列为优先防控的重大动物疫病之一。CSFV基因组长约12.3kb,仅含有一个大的开放性阅读框(ORF)，翻译成一种多聚蛋白，通过加工为1个结构蛋白和3个囊膜糖蛋白，即Ems(E0)、E1和E2，其中E2蛋白具有很好的免疫原性，能诱导机体产生高水平的病毒中和抗体,CSFV表面的单抗决定簇主要分布在E2蛋白上。
[0003]我国于1954年成功研制猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)推广至今，我国的猪瘟疫情得到了有效控制，但未根除。目前被广泛应用的CSFV疫苗株有中国的C株、日本的GPE株、法国的Thiverval株等，其中中国的C株是国际上公认的安全有效的疫苗株，该毒株免疫原性好、免疫谱广、安全性高、遗传性稳定。2008年，中国兽药监测所等单位利用猪瘟兔化弱毒疫苗接种传代细胞，成功研制出的新一代的猪瘟弱毒活疫苗，获农业部批准生产。猪瘟免疫防控的疫苗仍以猪瘟兔化弱毒细胞苗、传代细胞苗、脾淋苗为主。但经典C株不能区分野毒株感染，免疫效果易受母源抗体的干扰，给猪瘟疫病的防治及净化带来了很大的困难。亚单位疫苗目前国内普及使用较少。获得文号厂家目前只有一家。
[0004]猪伪狂犬病是由伪狂犬病病毒(PRV)引起的多种动物以发热、奇痒及脑脊髓炎为主要症状的一种急性传染病。目前，伪狂犬病在世界范围内广泛流行，其中猪最易感，发病也最严重，是病毒的长期储存者和排毒者，且具有高致死率。疫苗接种是预防、控制甚至消灭猪伪狂犬病主要的措施之一。国内外已研制出猪伪狂犬病的灭活疫苗、弱毒疫苗、基因缺失弱毒疫苗已经相对成熟弱毒活疫苗是将分离到的野毒株经非猪源细胞反复传到，或适应鸡胚、或加入致突变剂在高于一般的培养温度下，在细胞上反复传代而获得的疫苗，如匈牙利的Bartha株、罗马尼亚的Bucharest株、BUK株、TK200株等。我国广泛使用的PR弱毒冻干疫苗(Bartha
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K61)是gI/gE双击因缺失弱毒疫苗，由于该基因缺失而进一步阻断弱毒疫苗返毒的可能性。但弱毒活疫苗与E2联合使用时存在抗原相容性问题，且仍然存在不能区分野毒株感染，免疫效果易受母源抗体的干扰的问题。
[0005]为有效预防猪瘟和猪伪狂犬病这2种疾病，同时区分野毒株感染，国内外有许多相关亚单位疫苗的研究，但全部为单苗，关于CSFV和PRV二联亚单位疫苗未见报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或如SEQ ID NO.2所示。
[0007]本专利技术还提供了一种重组载体，它是包含权利要求1所述基因片段的质粒；所述质粒为pCHO1.0质粒。
[0008]本专利技术还提供了一种重组细胞，它是包括前述重组载体的大肠杆菌、酵母、昆虫、植物或者哺乳动物细胞中的任一种，优选哺乳动物细胞。
[0009]进一步地，所述哺乳动物细胞为CHO细胞；所述CHO细胞包括CHO
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K1、CHO
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S、CHO
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DXB11、CHO
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DG44、CHOZN GS、CHOK1SV GS
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KO，优选CHO
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S。
[0010]本专利技术还提供了一种重组蛋白，它是前述重组细胞表达的蛋白，其中由SEQ ID NO.1所示核苷酸序列翻译的蛋白为猪瘟E2蛋白，由SEQ ID NO.2所示核苷酸序列翻译的蛋白为猪伪狂犬病毒gD蛋白。
[0011]本专利技术还提供了一种前述重组蛋白的制备方法，它包括以下步骤：
[0012]1)取前述基因片段，与双酶切后的表达载体连接，再导入大肠杆菌，提取具有如SEQ ID NO.1所示或如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的质粒，线性化后转染到哺乳动物细胞中，加压筛选，得稳转细胞系；
[0013]2)取稳定细胞系，发酵培养，收集上清，纯化，即得。
[0014]进一步地，步骤1)所述表达载体为pCHO1.0质粒载体；所述大肠杆菌细胞为大肠杆菌TOP10感受态细胞；所述哺乳动物细胞为CHO细胞；所述转染的方式为脂质体转染；所述加压筛选是用含20nM MTX的CHO培养基培养至细胞活率96％，共两次；和/或，步骤2)所述取稳定细胞系，经ELISA法和/或HPLC法筛选，取表达量最高的单克隆细胞，采用流加培养方式发酵培养，收集上清，亲和层析纯化，即得。
[0015]本专利技术最后提供了一种亚单位疫苗，它是由质量比9：1的前述重组蛋白与ISA15A佐剂制成的疫苗。
[0016]进一步地，所述重组蛋白中E2蛋白与gD蛋白的比例为1：1。
[0017]更进一步地，所述重组蛋白的浓度为20～50μg/ml，优选25μg/ml。
[0018]本专利技术采用将截去跨膜疏水区的猪瘟E2蛋白、伪狂犬gD蛋白基因重组构建至进pCHO1.0质粒，并将重组后质粒通过脂质体转染，双加压筛选的方式方法成功构建了稳定表达猪瘟E2蛋白、及伪狂犬gD蛋白的CHO工程细胞系。通过所构建的CHO工程细胞系表达的猪瘟E2蛋白、伪狂犬gD蛋白免疫原性好，表达产量高，免疫后便于临床血清诊断及猪场猪瘟、伪狂犬病原的净化，可一针两防，减少免疫次数和应激反应，具有较高的经济效益和市场前景。
[0019]显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0020]以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。
附图说明
[0021]图1克隆前后pCHO1.0质粒图谱(A：E2蛋白转染质粒图谱；B：gD蛋白转染质粒图谱)
[0022]图2转染质粒的酶切鉴定(1、5：Marker15000Da；2：E2蛋白切转化质粒XmaJI、Bst1107I双酶切；3：线性E2蛋白转化质粒；4：E2蛋白质粒；
[0023]6：gD蛋白转化质粒XmaJI、Bst1107I双酶切；7：gD蛋白转化质粒)
[0024]图3琼脂糖凝胶电泳鉴定E2蛋白转化质粒PCR结果(1～10：E2蛋白转染质粒转化TOP10后单克隆；11：阴性对照；12：阳性对照；A～E：gD蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因片段，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或如SEQ ID NO.2所示。2.一种重组载体，其特征在于：它是包含权利要求1所述基因片段的质粒；所述质粒为pCHO1.0质粒。3.一种重组细胞，其特征在于：它是包括权利要求2所述重组载体的大肠杆菌、酵母、昆虫、植物或者哺乳动物细胞中的任一种，优选哺乳动物细胞。4.根据权利要求3所述的重组细胞，其特征在于：所述哺乳动物细胞为CHO细胞；所述CHO细胞包括CHO
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K1、CHO
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S、CHO
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DXB11、CHO
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DG44、CHOZN GS、CHOK1SV GS
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KO，优选CHO
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S。5.一种重组蛋白，其特征在于：它是权利要求3所述重组细胞表达的蛋白，其中由SEQ ID NO.1所示核苷酸序列翻译的蛋白为猪瘟E2蛋白，由SEQ ID NO.2所示核苷酸序列翻译的蛋白为猪伪狂犬病毒gD蛋白。6.一种权利要求5所述重组蛋白的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：1)取权利要求1所述基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁雪林，岳丰雄，刘汉平，邓菲，欧仁芳，牛艺霏，范芳芳，林艳，项聪英，
申请(专利权)人：成都史纪生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：