一种猪繁殖与呼吸综合征血清中和抗体检测方法技术

本发明专利技术提供了一种猪繁殖与呼吸综合征血清中和抗体检测方法，属于生物技术领域。本发明专利技术检测方法包括如下步骤：(1)血清中和；(2)荧光染色；(3)根据间接免疫荧光试验结果对中和抗体效价判定。本发明专利技术猪繁殖与呼吸综合征血清中和抗体检测方法可以准确、有效测定猪繁殖与呼吸综合征病毒的中和抗体，克服了常规中和抗体检测方法难以检测到中和抗体或特异性差的问题，也解决了ELISA抗体检测方法与攻毒保护之间不具有的相关性的问题，同时减少了疫苗效力检验时采用攻毒保护试验所用时间，此外减少了疫苗效力检验的动物费用以及保证了动物福利，有效减少了成本，具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种猪繁殖与呼吸综合征血清中和抗体检测方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合征血清中和抗体检测方法。

技术介绍

[0002]猪繁殖与呼吸综合征主要引起妊娠母猪繁殖障碍和生长猪呼吸系统疾病，还可以导致感染猪的免疫抑制，临床上容易引起继发或混合感染。猪繁殖与呼吸综合征最早于20世纪80年代末流行于北美，随后在欧洲、亚洲等许多养猪国家流行，现已成为严重影响全球养猪业的重要病原。
[0003]目前市场上存在着各种各样的猪繁殖与呼吸综合征疫苗，包括弱毒活疫苗及灭活疫苗，厂家众多，产品众多。在疫苗产品的效力评价方法中，最为科学准确的方法就是进行攻毒保护试验，但其成本偏高，且耗时较长，不适用于生产上每批次产品的效力检验。其次是ELISA抗体检测，市面上认可度较高的PRRSV ELISA抗体检测试剂盒厂家是IDEXX，但其ELISA抗体的高低与攻毒保护之间没有明显的相关性，且PRRSV存在抗体依赖性增强效应，在较低的抗体水平可能促使该病毒的增殖，从而加速该病的爆发。此外，评价疫苗免疫效力的有效指标还有中和抗体，但猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫后产生的中和抗体较低，传统中和抗体检测方法通过观察细胞病变情况，很难检测到中和抗体，无法真实反应血清中和能力，特别是对于灭活疫苗，中和抗体更是难以检测到。专利CN112379105A公开了一种PRRSV的IPMA中和抗体检测方法，但是该检测方法检测特异性较差，容易出现假阳性，染色背景高。
[0004]因此，开发出一种成本低、且相对准确测定猪繁殖与呼吸综合征病毒的中和抗体的方法，对于猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗，特别是灭活疫苗免疫效力的评估具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种猪繁殖与呼吸综合征血清中和抗体检测方法。
[0006]本专利技术提供了一种猪繁殖与呼吸综合征血清中和抗体检测方法，它包括如下步骤：
[0007](1)血清中和：将注射疫苗免疫后的血清与等体积猪繁殖与呼吸综合征病毒液混匀，孵育后接种到Marc145细胞中；同时设立只接种猪繁殖与呼吸综合征病毒液的阳性细胞对照孔；
[0008](2)荧光染色：接种到细胞中培养后，对细胞进行间接免疫荧光试验，依次加入抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的小鼠单抗和FITC标记的羊抗小鼠IgG的二抗进行孵育，然后观察；
[0009](3)根据间接免疫荧光试验结果对中和抗体效价判定：当血清样品中和孔中绿色荧光数与阳性细胞对照孔相比，减少40％以上则判定为有中和效力；未减少40％则判定为
无中和效力。
[0010]进一步地，步骤(1)中，所述血清的制备方法包括如下步骤：采集猪的血液，分离血清，用于中和抗体测定；
[0011]和/或，步骤(1)中，所述血清使用前进行灭活、除菌；
[0012]优选地，所述猪为进行疫苗免疫后的猪；
[0013]和/或，步骤(1)中，所述血清使用前进行56℃水浴灭活30分钟，并用0.22μm滤器过滤除菌。
[0014]进一步地，步骤(1)中，所述血清和病毒液均用培养基稀释；
[0015]优选地，步骤(1)中，所述培养基为无血清培养基。
[0016]进一步地，步骤(1)中，所述血清与病毒液混匀时，血清用培养基按照2的倍比稀释；和/或，病毒液用培养基稀释至含量为2000TCID
50
/ml；
[0017]和/或，步骤(1)中，阳性细胞对照孔中，病毒液用培养基稀释至含量为1000、100、10TCID
50
/ml；
[0018]优选地，步骤(1)中，所述血清与病毒液混匀时，血清用培养基按照1：2、1:4、1:8或1:16的稀释度稀释。
[0019]进一步地，步骤(1)中，所述血清与病毒液孵育的温度为37
±
2℃；和/或，所述血清与病毒液孵育时间为0.5～1.5h；和/或，所述血清与病毒液孵育时间隔20～30分钟摇匀一次；
[0020]和/或，步骤(1)中，所述接种到细胞中后培养时间为24～72h；和/或，所述样品培养的温度为37
±
2℃；
[0021]优选地，所述接种到细胞中后培养时间为46h。
[0022]进一步地，步骤(2)中，所述进行间接免疫荧光试验前对细胞进行固定；
[0023]优选地，所述固定为使用丙酮固定；和/或，所述固定的温度为0～4℃；和/或，所述固定的时间为30～60分钟；
[0024]更优选地，所述丙酮为浓度为75～85％的丙酮。
[0025]进一步地，步骤(2)中，所述加入抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的小鼠单抗后孵育温度为37
±
2℃；和/或，所述加入抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的小鼠单抗后孵育时间为0.5～1.5h；和/或，所述孵育结束后用PBS清洗；
[0026]和/或，步骤(2)中，所述加入FITC标记的羊抗小鼠IgG的二抗后孵育温度为37
±
2℃；和/或，所述加入FITC标记的羊抗小鼠IgG的二抗后孵育时间为0.5～1.5h；和/或，所述孵育结束后用PBS清洗。
[0027]进一步地，步骤(3)中，所述中和抗体效价判定时，设置培养基阴性对照孔，试验成立条件为：阴性对照的孔不能出现绿色荧光，阳性细胞对照孔出现绿色荧光。
[0028]进一步地，步骤(3)中，所述阳性细胞对照孔出现绿色荧光具体为：1000TCID
50
/ml的病毒液细胞对照孔全部出现绿色荧光，100TCID
50
/ml的病毒液细胞对照孔全部出现绿色荧光，10TCID
50
/ml的病毒液细胞对照孔有1/2～1/3孔中有绿色荧光。
[0029]进一步地，步骤(3)中，根据有中和效力的孔数，依照Reed
‑
Muench法计算中和抗体效价。
[0030]与现有技术相比，本申请的有益效果为：
[0031]本专利技术猪繁殖与呼吸综合征血清中和抗体检测方法可以准确、有效测定猪繁殖与呼吸综合征病毒的中和抗体，克服了常规中和抗体检测方法难以检测到中和抗体或特异性差的问题，也解决了ELISA抗体检测方法与攻毒保护之间不具有的相关性的问题，同时减少了疫苗效力检验时采用攻毒保护试验所用时间，此外减少了疫苗效力检验的动物费用以及保证了动物福利，有效减少了成本，具有良好的应用前景。
[0032]显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0033]以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。
附图说明
[0034]图1为不同血清稀释倍数中和效果图。
[0035]图2为1000TCID<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪繁殖与呼吸综合征血清中和抗体检测方法，其特征在于：它包括如下步骤：(1)血清中和：将注射疫苗免疫后的血清与等体积猪繁殖与呼吸综合征病毒液混匀，孵育后接种到Marc145细胞中；同时设立只接种猪繁殖与呼吸综合征病毒液的阳性细胞对照孔；(2)荧光染色：接种到细胞中培养后，对细胞进行间接免疫荧光试验，依次加入抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的小鼠单抗和FITC标记的羊抗小鼠IgG的二抗进行孵育，然后观察；(3)根据间接免疫荧光试验结果对中和抗体效价判定：当血清样品中和孔中绿色荧光数与阳性细胞对照孔相比，减少40％以上则判定为有中和效力；未减少40％则判定为无中和效力。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)中，所述血清的制备方法包括如下步骤：采集猪的血液，分离血清，用于中和抗体测定；和/或，步骤(1)中，所述血清使用前进行灭活、除菌；优选地，所述猪为进行疫苗免疫后的猪；和/或，步骤(1)中，所述血清使用前进行56℃水浴灭活30分钟，并用0.22μm滤器过滤除菌。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)中，所述血清和病毒液均用培养基稀释；优选地，步骤(1)中，所述培养基为无血清培养基。4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)中，所述血清与病毒液混匀时，血清用培养基按照2的倍比稀释；和/或，病毒液用培养基稀释至含量为2000TCID
50
/ml；和/或，步骤(1)中，阳性细胞对照孔中，病毒液用培养基稀释至含量为1000、100、10TCID
50
/ml；优选地，步骤(1)中，所述血清与病毒液混匀时，血清用培养基按照1：2、1:4、1:8或1:16的稀释度稀释。5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)中，所述血清与病毒液孵育的温度为37
±
2℃；和/或，所述血清与病毒液孵育时间为0.5～1.5h；和/或，所述血清与病毒液孵育时间隔20...

【专利技术属性】
技术研发人员：林艳，刘汉平，陈莉群，郑琴勤，夏嘉鑫，杨勇，岳丰雄，项聪英，袁雪林，
申请(专利权)人：成都史纪生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：