一种猪支原体肺炎灭活疫苗效力评估方法技术

本发明专利技术提供了一种基于豚鼠DTH的猪支原体肺炎灭活疫苗效力评估方法，包括向豚鼠皮下注射猪支原体肺炎灭活疫苗并加强免疫后，注射猪肺炎支原体抗原诱导DTH反应，根据形成的红斑大小计算硬结反应直径，进而评估疫苗效力的步骤。本发明专利技术相比于免疫攻毒法、IHA法，成本低廉、操作简便、能很好的反应疫苗免疫后的细胞免疫应答水平，是一种针对猪支原体肺炎疫苗免疫后效果评估的新方法。效果评估的新方法。

【技术实现步骤摘要】
一种猪支原体肺炎灭活疫苗效力评估方法


[0001]本专利技术涉及疫苗效力评估领域，具体涉及一种猪支原体肺炎灭活疫苗效力评估方法。

技术介绍

[0002]猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，MHP)可引起猪只的支原体肺炎(Mycoplasmal pneu
‑
monia of swine，MPS)，该病的流行与存在长期困扰着世界各地养猪业的健康发展。该病具有发病率高、死亡率低的特点，是一种猪慢性接触性呼吸道传染病。疫苗接种是预防和净化猪支原体肺炎的最有效手段。目前市售疫苗主要有灭活疫苗和活疫苗，其中灭活疫苗以体液免疫为主，活疫苗以细胞免疫为主。
[0003]传统猪支原体肺炎疫苗的效力检验方法包括免疫攻毒法、间接血凝试验(IHA)法。其中免疫攻毒法是通过针对猪只免疫后用强毒攻毒，然后观察肺脏胰样肉变的情况来判定疫苗免疫后保护效果，该方法可以直观有效的判断出疫苗免疫保护效果，但其成本较高且通过肉眼观察病变的方式容易受到人为因素干扰。IHA法是通过检测疫苗免疫大耳白兔后抗体水平的高低从而判定疫苗免疫后保护效果，该方法可以直接反映免疫后血清中抗体水平的高低，但其容易受到试剂盒检测中试剂的干扰且成本依旧较高。
[0004]迟发型超敏反应(DTH)，是由效应性T细胞与相应抗原作用后，引起的以单个核细胞浸润和组织细胞损伤为主要特征的炎症反应，猪肺炎支原体(MHP)感染后细胞免疫能力下降，但是通过疫苗免疫后能显著增加细胞免疫水平，且产生的CD4
+
T细胞多于CD8
+
T细胞，当MHP抗原再次刺激机体后，由CD4
+
T细胞释放的大量细胞因子可导致明显的炎性反应，最终导致以单个核细胞浸润为主的炎症反应及细胞变性坏死。根据炎性反应强烈程度可以一定程度上反推细胞免疫水平从而评价疫苗免疫效果。
[0005]然而，对于炎症反应强烈程度的判断目前仍掺杂较多人为主观因素，尚无系统、标准化的，并且检测结果准确的检测方法报道，若能提供基于DTH的检测方法，将有利于降低成本，为猪支原体肺炎疫苗的效力评估提供新的选择。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种基于DTH的猪支原体肺炎灭活疫苗效力评估方法。
[0007]本专利技术提供了一种猪支原体肺炎灭活疫苗效力评估方法，包括如下步骤：
[0008](1)向豚鼠皮下注射猪支原体肺炎灭活疫苗，注射后10～21日以相同剂量第二次注射疫苗加强免疫；
[0009](2)第二次注射疫苗后10～30日，向豚鼠背部不同部位皮内注射等体积的不同检测试剂，所述检测试剂包括：植物血球凝集素溶液和猪肺炎支原体抗原溶液；所述肺炎支原体浓度为10
9.0
～10
10.0
CCU/ml；
[0010](3)注射后24小时，分别测量和计算不同检测试剂注射部位出现的红斑大小，计算硬结反应比值；所述硬结反应比值的计算方法为：
[0011]r＝d
s
/d0[0012]其中r是硬结反应比值，d
s
是注射猪肺炎支原体抗原溶液部位的红斑大小，d0是注射植物血球凝集素溶液部位的红斑大小。
[0013]进一步地，上述红斑大小是指平均红斑直径或红斑面积；
[0014]优选地，所述平均红斑直径的计算方法为：
[0015]d＝(d1+d2)/2，
[0016]其中d是平均红斑直径，d1是红斑纵向直径，d2是红斑横向直径。
[0017]进一步地，上述豚鼠是SPF级别豚鼠。
[0018]进一步地，上述步骤(1)所述第二次注射是在第一次注射后14日。
[0019]进一步地，上述步骤(1)所述疫苗的注射剂量为0.1～0.4mL/只，优选为0.2mL/只。
[0020]进一步地，上述步骤(2)所述不同检测试剂的注射是在第二次注射疫苗后21日。
[0021]进一步地，上述步骤(2)所述猪肺炎支原体抗原是猪肺炎支原体发酵菌液纯化并超声破碎后得到的抗原。
[0022]更进一步地，上述猪肺炎支原体抗原是按照如下步骤制备得到的抗原：
[0023](a)收集发酵的猪肺炎支原体菌液；
[0024](b)4℃离心，沉淀重悬，重复三次，最后一次重悬控制菌液中菌体浓度为10
9.0
～10
10.0
CCU/ml；
[0025](c)取步骤(b)得到的菌液经
‑
80℃冻融，超声破碎，得到超声破碎抗原。
[0026]更进一步地，上述步骤(c)所述超声破碎是：以300W功率超声破碎3次，每次8min。
[0027]进一步地，上述步骤(2)还包括向豚鼠背部与检测试剂注射部位不同的部位皮内注射等体积生理盐水作为阴性对照的步骤。
[0028]本专利技术的有益效果：
[0029]本专利技术提供的基于豚鼠DTH的猪支原体肺炎灭活疫苗效力评估方法，相比于免疫攻毒法、IHA法，本专利技术成本低廉、操作简便、能直接、有效地反应疫苗免疫后的细胞免疫应答水平，是一种可准确评估猪支原体肺炎疫苗免疫后效果的新方法。
[0030]本专利技术“平均红斑直径”是指：以通过红斑重心且端点在红斑边缘的线段作为直径，测量n条不同的直径长度，求n条直径的长度平均值即为平均红斑直径，n是不小于2的整数。
[0031]显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0032]以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。
具体实施方式
[0033]本专利技术所用阳性标准品：植物血球凝集素(PHA)购自Sigma，货号L1668
‑
5MG。其主要作用机理为刺激T细胞增殖分化产生大量效应T细胞和细胞毒T细胞；效应T细胞分泌产生大量细胞因子(如干扰素等)，是可用于评价细胞免疫应答的阳性标准物质。本专利技术所用阴性标准品：0.8％生理盐水。
[0034]除另有说明外，本专利技术所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
[0035]实施例1、本专利技术猪支原体肺炎灭活疫苗效力评估
[0036]将300～400g SPF豚鼠15只，随机分成3组，每组5只，Ⅰ组免疫商品苗1、Ⅱ组免疫商品名2、Ⅲ组免疫商品苗3，3种商品名分别购自不同厂家。每组每只豚鼠腹股沟皮下分点注射疫苗0.2ml(0.1～0.4ml均可，最佳0.2ml)，免疫后14日(10～21日均可，最佳14日)用相同剂量加强免疫一次。加强免疫后21日(10～30日均可，最佳为21日)，背部皮内分三点注射猪肺炎支原体纯化超声破碎抗原0.1ml(30ug/ml)、阳性对照用植物血球凝集素PHA0.1ml(30u本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪支原体肺炎灭活疫苗效力评估方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)向豚鼠皮下注射猪支原体肺炎灭活疫苗，注射后10～21日以相同剂量第二次注射疫苗加强免疫；(2)第二次注射疫苗后10～30日，向豚鼠背部不同部位皮内注射等体积的不同检测试剂，所述检测试剂包括：植物血球凝集素溶液和猪肺炎支原体抗原溶液；所述肺炎支原体浓度为10
9.0
～10
10.0
CCU/ml；(3)注射后24小时，分别测量和计算不同检测试剂注射部位出现的红斑大小，计算硬结反应比值；所述硬结反应比值的计算方法为：r＝d
s
/d0其中r是硬结反应比值，d
s
是注射猪肺炎支原体抗原溶液部位的红斑大小，d0是注射植物血球凝集素溶液部位的红斑大小。2.如权利要求1所述的评估方法，其特征在于，所述红斑大小是指平均红斑直径或红斑面积。3.如权利要求1所述的评估方法，其特征在于，所述豚鼠是SPF级别豚鼠。4.如权利要求1所述的评估方法，其特征在于，步骤(1)所述第二次注射是在第一次注射后14日。5.如权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘汉平，林艳，岳丰雄，陈莉群，夏嘉鑫，郑勤琴，杨勇，项聪英，
申请(专利权)人：成都史纪生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：