一种检验猪圆环病毒2型灭活疫苗效力的方法技术

本发明专利技术公开了一种检验猪圆环病毒2型灭活疫苗效力的方法，属于生物技术领域。本发明专利技术的方法对小鼠免疫疫苗后采集血清，通过检测血清中PCV2特异性中和抗体的水平来达到检验PCV2疫苗效力的目的。本发明专利技术提供的检验猪圆环病毒2型灭活疫苗效力的方法克服了传统仔猪攻毒法中试验猪筛选费时、费力，检验结果批次间差异大等问题，避免了试验猪剖杀，病毒分离等步骤。本发明专利技术的检验方法能够真实的反映猪圆环病毒2型灭活疫苗的免疫效果，操作简单，节约成本，耗时短，敏感性强，稳定性高，在检验猪圆环病毒2型病毒疫苗效力中具有广阔的应用前景。型病毒疫苗效力中具有广阔的应用前景。型病毒疫苗效力中具有广阔的应用前景。

A method for testing the efficacy of Inactivated Porcine Circovirus Type 2 vaccine

【技术实现步骤摘要】
一种检验猪圆环病毒2型灭活疫苗效力的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种检验猪圆环病毒2型灭活疫苗效力的方法。

技术介绍

[0002]猪圆环病毒属于圆环病毒科圆环病毒属，是目前发现的最小的动物病毒。猪圆环病毒2型(PCV2)能引起猪的多系统功能性障碍疾病，如仔猪断奶衰竭综合征、猪皮炎与肾病综合征、猪呼吸道疾病综合征等，临床主要表现为：猪体质下降，腹泻，消瘦，咳嗽，喘气，呼吸困难，贫血和黄疸。猪感染猪圆环病毒后，可导致猪群特别是仔猪阶段严重的免疫抑制，从而容易继发或并发其他传染病，主要有蓝耳病(PRRS)，猪瘟病(CSF)，猪支原体肺炎，副猪嗜血杆菌病，猪溶血型链球菌病等。因此，开发猪圆环病毒2型病毒疫苗至关重要。
[0003]但是，现如今市场上疫苗接种引起的PCV2的演变和微妙的选择压力可能会导致病毒变异，存在不可预测的情况和风险，因此不断地更新疫苗变得尤其重要。在开发新疫苗的过程中，检验疫苗的效力是一个关键的环节。
[0004]目前检验PCV2疫苗效力的方法通常为仔猪攻毒法。但是，我国猪群PCV2感染严重，目前市面上的PCV2抗体阴性猪数量少，试验猪只的筛选存在困难，不利于开展PCV2灭活疫苗猪体安全性及效力性试验。而且，仔猪攻毒法还存在费时、费力、费钱，PCV2攻毒模型建立困难、不稳定，检验结果批次间差异大的问题。因此，研究新的检验PCV2疫苗效力的方法具有重要意义。
[0005]申请号为201611140272.7的中国专利申请公开了一种猪圆环病毒2型灭活疫苗效力的检验方法，步骤如下：(1)小白鼠抗体水平测定：
①
小白鼠的免疫：将猪圆环病毒2型疫苗经皮下免疫小白鼠，10
‑
21天后再按照相同的免疫途径和剂量进行加强免疫一次；
②
小白鼠抗体水平的测定：加强免疫，14
‑
28天后，处死小白鼠，采集并分离血清，测定抗体水平；(2)通过测定小白鼠的抗体水平判断疫苗效力检验是否合格的方法：
①
免疫小白鼠抗体水平与免疫猪抗体水平，攻毒保护试验的结果之间具有平行关系；
②
根据测定的小白鼠抗体水平判断该疫苗效力检验是否合格，所述检测小白鼠抗体水平大于1:400，作为样品疫苗检验合格的标准，即可以达到对猪群产生80％保护率。该方法克服了传统仔猪攻毒法中试验猪筛选费时、费力及试验结果批次间差异大等问题，但是，这种方法检测的是抗体水平，而非中和抗体水平，不能真实的反映猪圆环病毒2型灭活疫苗的免疫效果。
[0006]因此，亟需开发出一种不仅能够克服传统仔猪攻毒法中试验猪筛选费时、费力及试验结果批次间差异大等问题，还能够更真实的反映猪圆环病毒2型灭活疫苗的免疫效果的方法来检验PCV2疫苗的效力。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种检验猪圆环病毒2型灭活疫苗效力的新方法。
[0008]本专利技术提供了一种检验PCV2疫苗效力的方法，所述方法包括以下步骤：
[0009](1)小鼠免疫：利用PCV2疫苗对小鼠进行首次免疫，10
‑
18天后进行加强免疫；
[0010](2)检测血清PCV2中和抗体效价：加强免疫14
‑
28天后，采集血清，检测血清PCV2中和抗体效价；其中，检测血清PCV2中和抗体效价的方法包括以下步骤：
[0011]a)将血清用培养基进行倍比稀释，得到不同浓度的血清稀释液；将PCV2细胞毒用培养基稀释，得到病毒稀释液；将病毒稀释液分别与不同浓度的血清稀释液混合，得到不同浓度的中和组样品；将病毒稀释液与同血清稀释液等体积的培养基混合，得到病毒对照组样品；
[0012]b)制备细胞悬浮液；
[0013]c)分别将不同浓度的中和组样品、病毒对照组样品加入细胞培养板，同时加入细胞悬浮液，共培养后弃去上清液，洗涤，加固定液固定细胞；
[0014]d)弃去固定液，洗涤，加入一抗，孵育；
[0015]e)弃去上清液，洗涤，加入酶标二抗，孵育，弃去上清液，洗涤；
[0016]f)加入显色液进行显色；
[0017]g)判断中和效力：与病毒对照组相比，中和组PCV2阳性细胞数减少88％～92％判断为具有中和效力；
[0018](3)检验疫苗效力：根据血清PCV2中和抗体效价判断PCV2疫苗的效力，若PCV2中和抗体效价大于等于1：600，则PCV2疫苗对猪的攻毒保护率大于等于80％。
[0019]进一步地，步骤(1)中，所述疫苗为灭活疫苗；和/或，所述小鼠为SPF小鼠。
[0020]进一步地，步骤(1)中，首次免疫14天后进行加强免疫。
[0021]进一步地，步骤(1)中，首次免疫和加强免疫的方式为腹腔注射PCV2疫苗。
[0022]进一步地，步骤(2)中，加强免疫21天后采集血清。
[0023]进一步地，步骤a)中，所述病毒稀释液的病毒含量为(1～3)
×
103TCID
50
/ml，优选为2
×
103TCID
50
/ml。
[0024]进一步地，步骤b)中，所述细胞为猪细胞，优选为pk15细胞。
[0025]进一步地，步骤c)中，所述固定液为丙酮溶液。
[0026]进一步地，步骤d)中，所述一抗为鼠抗PCV2
‑
Cap单克隆抗体；步骤e)中，所述酶标二抗为HRP标记兔抗鼠二抗。
[0027]进一步地，步骤g)中，与病毒对照组相比，中和组PCV2阳性细胞数减少90％判断为具有中和效力。
[0028]本专利技术的方法对SPF小鼠(即无特定病原体小鼠)免疫疫苗后采集血清，通过检测血清中PCV2特异性中和抗体的水平来达到检验PCV2疫苗效力的目的。在检测血清中PCV2特异性中和抗体的水平时，专利技术人发现将样品中和孔中的PCV2阳性细胞数与病毒对照孔的阳性细胞数相比减少90％判为具有中和效力作为判定标准时，检测结果可控，稳定，误差小，能够更真实的反映猪圆环病毒2型灭活疫苗的免疫效果。
[0029]本专利技术提供的检验猪圆环病毒2型灭活疫苗效力的方法克服了传统仔猪攻毒法中试验猪筛选费时、费力，检验结果批次间差异大等问题，避免了试验猪剖杀，病毒分离等步骤。本专利技术的检验方法能够真实的反映猪圆环病毒2型灭活疫苗的免疫效果，操作简单，节约成本，耗时短，敏感性强，稳定性高，在检验猪圆环病毒2型病毒疫苗效力中具有广阔的应用前景。
[0030]显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0031]以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。
附图说明
[0032]图本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检验PCV2疫苗效力的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：(1)小鼠免疫：利用PCV2疫苗对小鼠进行首次免疫，10
‑
18天后进行加强免疫；(2)检测血清PCV2中和抗体效价：加强免疫14
‑
28天后，采集血清，检测血清PCV2中和抗体效价；其中，检测血清PCV2中和抗体效价的方法包括以下步骤：a)将血清用培养基进行倍比稀释，得到不同浓度的血清稀释液；将PCV2细胞毒用培养基稀释，得到病毒稀释液；将病毒稀释液分别与不同浓度的血清稀释液混合，得到不同浓度的中和组样品；将病毒稀释液与同血清稀释液等体积的培养基混合，得到病毒对照组样品；b)制备细胞悬浮液；c)分别将不同浓度的中和组样品、病毒对照组样品加入细胞培养板，同时加入细胞悬浮液，共培养后弃去上清液，洗涤，加固定液固定细胞；d)弃去固定液，洗涤，加入一抗，孵育；e)弃去上清液，洗涤，加入酶标二抗，孵育，弃去上清液，洗涤；f)加入显色液进行显色；g)判断中和效力：与病毒对照组相比，中和组PCV2阳性细胞数减少88％～92％判断为具有中和效力；(3)检验疫苗效力：根据血清PCV2中和抗体效价判断PCV2疫苗的效力，若PCV2中和抗体效价大于等于1：600，则PCV2疫苗对猪的攻毒保护率大于等于80％。2.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：林艳，刘汉平，郑琴勤，岳丰雄，夏嘉鑫，陈莉群，杨勇，袁雪林，项聪英，
申请(专利权)人：成都史纪生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：