一种猪细小病毒VP2蛋白基因及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种猪细小病毒VP2蛋白基因及其应用。本发明专利技术用重组表达的猪细小病毒结构蛋白，与佐剂乳化后，制成的疫苗安全性好，抗体效价高，免疫效力高，免疫持续期长，且该疫苗只需单次免疫即可达到理想的免疫效果，具备实际应用价值。用价值。用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种猪细小病毒VP2蛋白基因及其应用


[0001]本专利技术属于基因重组疫苗
，具体涉及一种猪细小病毒VP2蛋白基因

技术介绍

[0002]猪细小病毒(Porcine Parvovirus，PPV)耐受性极强且具有高度传染性，是导致母猪繁殖障碍的病原之一，猪细小病毒病的临床主要特征是妊娠母猪流产、胎儿死亡和木乃伊化。该病目前呈全球性分布，特别对妊娠母猪和仔猪危害较大，阻碍了猪养殖产业化进程，造成巨大经济损失。PPV是一种较小的无囊膜病毒，该病毒粒子外观呈六角形或圆形，二十面体立体对称，直径介于18
‑
26nm，基因组为单股负链DNA，全长约5000bp。VP2蛋白是构成PPV病毒的主要衣壳蛋白，约占PPV病毒衣壳蛋白总量的80％，由579个氨基酸组成，分子质量为64KU，其携带了主要的抗原决定簇，具有自组装成病毒样颗粒(VLP)的能力，具有良好的反应原性，可诱导动物机体产生免疫反应。
[0003]过去的PPV疫苗研制经历了从弱毒苗向灭活苗的发展过程，尽管这些疫苗的使用有效地控制了临床上PPV的感染，但弱毒疫苗存在毒力返强或重组的风险，同时灭活疫苗也存在因病毒灭活不彻底导致的散毒风险，在此情况下研制高效、安全的新型PPV疫苗对有效防控该病具有重要意义。VLPs疫苗由病毒结构蛋白自组装形成，不包含病毒核酸，可介导高效的体液免疫和细胞免疫应答，目前被认为是安全有效的候选疫苗。但目前还没有对免疫动物产生足够保护效力的重组猪细小病毒VP2蛋白疫苗的研究报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种猪细小病毒VP2蛋白基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0005]本专利技术还提供了一种重组载体，它包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
[0006]进一步地，它是连接有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的质粒载体；所述质粒载体为pFastBacDual质粒。
[0007]本专利技术还提供了一种表达猪细小病毒VP2蛋白基因的重组细胞，它是包括前述重组载体的大肠杆菌、酵母、昆虫、植物或者哺乳动物细胞中的任一种。
[0008]本专利技术还提供了一种重组猪细小病毒VP2蛋白，它是前述重组细胞表达的，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]本专利技术还提供了一种前述重组猪细小病毒VP2蛋白的制备方法，它包括以下步骤：
[0010]1)取前述猪细小病毒VP2蛋白基因片段，与双酶切后的表达载体连接，再导入大肠杆菌，提取具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的重组杆状病毒基因
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杆粒；
[0011]2)将步骤1)所得重组杆状病毒基因
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杆粒转染到昆虫细胞中进行病毒包装及重组蛋白表达，收集上清，即得。
[0012]进一步地，步骤1)所述表达载体为pFastBacDual质粒载体；所述导入大肠杆菌为导入大肠杆菌TOP10感受态细胞和/或大肠杆菌DH10Bac感受态细胞；和/或，步骤2)所述转
染到昆虫细胞为转染到Sf9细胞和/或High Five细胞。
[0013]更进一步地，所述导入大肠杆菌为先导入大肠杆菌TOP10感受态细胞，提取表达供体质粒，再将表达供体质粒导入大肠杆菌DH10Bac感受态细胞；所述转染到昆虫细胞为先转染到Sf9细胞，进行病毒包装及繁毒，再将重组杆状病毒转染到High Five细胞进行重组蛋白表达。
[0014]本专利技术一种重组猪细小病毒VP2蛋白疫苗，它是前述重组猪细小病毒VP2蛋白，经二乙烯亚胺灭活后加入201佐剂乳化制成的疫苗。
[0015]进一步地，所述二乙烯亚胺的浓度为0.2％w/w，灭活温度32℃，时间96h，灭活终止加入0.02％w/w硫代硫酸钠。
[0016]进一步地，所述重组猪细小病毒VP2蛋白与佐剂的质量比为1：1；所述乳化的搅拌速度为500rpm/min，时间10分钟。
[0017]本专利技术提供了一种猪细小病毒VP2蛋白基因，用该基因表达的重组猪细小病毒结构蛋白，与佐剂乳化后，制成的疫苗安全性好，抗体效价高，免疫效力高，免疫持续期长，且该疫苗只需单次免疫即可达到理想的免疫效果，具备实际应用价值。
[0018]显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0019]以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。
附图说明
[0020]图1VP2基因片段
[0021]图2构建的细小病毒VP供体质粒pFastPPV
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VP2
[0022]图3重组杆状病毒构建原理
[0023]图4P1重组杆状病毒接种sf9第4日细胞状态
[0024]图5重组杆状病毒接种HighFive第6日上清HA效价测定
[0025]图6PPV
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VP2 SDS
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PAGE凝胶电泳图
[0026]图7PPV
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VP2 VLP电镜照片
具体实施方式
[0027]实施例1重组猪细小病毒VP2蛋白疫苗研究
[0028]1、基因相关
[0029]1)化学合成猪细小病毒VP2蛋白序列
[0030]根据GeneBank细小病毒VP2蛋白序列(AY686602.1)合成相应的密码子优化的基因序列，如SEQ ID NO.1所示：
[0031]ATGTCAGAAAACGTAGAACAGCATAACCCAATTAATGCCGGTACGGAGTTGTCGGCTACCGGAAACGAATCTGGAGGGGGTGGTGGCGGCGGCGGCGGTAGAGGAGCGGGCGGCGTAGGAGTCTCTACAGGAAGTTTTAACAATCAGACTGAGTTCCAGTATCTCGGCGAGGGTCTAGTACGAATTACAGCGCACGCGAGTCGGCTGATTCATTTAAATATGCCGGAGCACGAGACGTATAAGAGGATACACGTGCTTAATTCTGAAAGTGGAGTGGCAGGCCAAATGGTACAGGACGATGCACATACGCAAATGGTTACACCCTGGTCACTAATTGACGCAAACGCGTGGGGGGTCTGGTTTAATCCTGCA
GATTGGCAATTGATATCGAACAACATGACAGAAATAAATCTTGTCTCGTTCGAACAGGAGATTTTTAACGTTGTCCTTAAGACTATAACAGAATCAGCTACCTCGCCCCCCACGAAAATATACAATAATGATTTAACGGCCAGTCTGATGGTGGCCTTAGACACGAACAATACTTTACCCTACACCCCTGCTGCGCCGCGGAGCGA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪细小病毒VP2蛋白基因片段，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种重组载体，其特征在于：它包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：它是连接有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的质粒载体；所述质粒载体为pFastBacDual质粒。4.一种表达猪细小病毒VP2蛋白基因的重组细胞，其特征在于：它是包括权利要求2和3所述重组载体的大肠杆菌、酵母、昆虫、植物或者哺乳动物细胞中的任一种。5.一种重组猪细小病毒VP2蛋白，其特征在于：它是权利要求4所述重组细胞表达的，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。6.一种权利要求5所述重组猪细小病毒VP2蛋白的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：1)取权利要求1所述猪细小病毒VP2蛋白基因片段，与双酶切后的表达载体连接，再导入大肠杆菌，提取具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的重组杆状病毒基因
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杆粒；2)将步骤1)所得重组杆状病毒基因
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杆粒转染到昆虫细胞中进行病毒包装及重组蛋白表达，收集上清，即得。7....

【专利技术属性】
技术研发人员：张冬冬，岳丰雄，刘汉平，李姝蕊，林艳，李刚，项聪英，
申请(专利权)人：成都史纪生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：