一种利用大肠杆菌表达猫细小VP2蛋白自主组装病毒样颗粒的制备制造技术

本发明专利技术属于疫苗制备技术领域，涉及一种新型猫细小病毒疫苗，公开了一种猫细小病毒VP2蛋白的编码基因，通过基因工程技术编码优化FPV VP2蛋白序列，构建重组质粒，利用大肠杆菌表达重组蛋白，并分别与四种分子伴侣共表达FPV VP2蛋白。经不同种纯化方法纯化目的蛋白，获得与天然病毒大小相似，具有良好血凝性的病毒样颗粒。为新型猫细小病毒疫苗提供新的思路和基础。和基础。

【技术实现步骤摘要】
一种利用大肠杆菌表达猫细小VP2蛋白自主组装病毒样颗粒的制备


[0001]本专利技术属于VLP疫苗领域。本专利技术涉及利用大肠杆菌系统重组表达FPV主要衣壳蛋白VP2，并自组装成病毒样颗粒。因外源基因在大肠杆菌中高效表达时有的胞内蛋白质浓度过高，无充分时间进行折叠从而形成非结晶，无定形的蛋白质聚集体。本专利技术采用与四种分子伴侣pG
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KJE7、pG
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KJE8、pGro7和pTf16共表达来提高可溶蛋白的比例。经不同种方法纯化后的蛋白在本专利技术特定的环境下能够形成颗粒均一，形态良好，大小相似于天然病毒的病毒样颗粒。为研究猫细小病毒的VLP疫苗提供基础，进一步解决宠物猫及猫科动物所面临的问题。

技术介绍

[0002]猫细小病毒(feline parvovirus，FPV)又称猫泛白减少症病毒，猫瘟热病毒，猫传染性肠炎病毒。猫感染细小病毒后症状表现为突发双相热，呕吐，腹泻，脱水，精神倦怠，食欲废绝，导致淋巴细胞和嗜中性白细胞减少。该病毒主要感猫及猫科动物(如野猫，虎，豹，猞猁，水貂，山猫，豹猫等)，以及非猫科的浣熊，貂，及环尾等。主要发生于12月龄以下小猫，尤其3
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6月龄幼猫易感。且妊娠期母猫能够垂直传播于胎儿，感染后可发生死胎，流产或者畸形。是目前肉食兽细小病毒属感染范围最广，致病性最强的一种病毒。由于FPV给我国宠物猫行业以及野生动物保护造成极大的危害，抓紧研制新型疫苗才是重中之重。目前，还没有应对FPV的特效药物以及有效的治疗方法。接种疫苗是控制FPV流行的有效方法。常用的FPV疫苗有灭活苗和弱毒苗。FPV灭活苗在制备过程中其保护性抗原蛋白易发生变性，免疫效果不理想。弱毒疫苗虽然能有效诱导机体产生特异性免疫应答，但易受母源抗体的干扰，并存在毒力返祖的潜在危险，不够安全健康。
[0003]FPV是一种单股无囊膜DNA病毒，直径20nm
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24nm，呈二十面体对称。FPV具有回文结构，其中3
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端的结构长度固定，但5
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端的结构长度不一，可含有1
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3个重复序列。5
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端ORF编码非结构蛋白NS1和NS2。3
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端ORF编码结构蛋白VP1和VP2。VP2蛋白是细小病毒外壳的主要成分，VP2蛋白是免疫原性蛋白，可诱导机体产生中和抗体。VP2基因上的几个关键碱基和氨基酸的变化就会改变抗原特性。细小病毒各种检测方法的建立和基因工程疫苗的研发也主要依赖VP2蛋白。
[0004]蛋白质是细胞中执行生命活动的主要大分子，必须有效折叠成正确的空间结构才能行使其功能，生物体内许多新合成的蛋白质的有效折叠需要分子伴侣的协助。细胞内新合成的肽链大多数都不是自发折叠的，而是在分子伴侣蛋白介导中获得了天然构象。分子伴侣在空间和时间上控制多肽链的折叠过程，从而降低错误折叠的可能性，促进蛋白质的正确折叠。本专利技术通过pG
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KJE7、pG
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KJE8、pGro7和pTf16四种分子伴侣在ER2566细胞中共表达增加了可溶蛋白的比例，在特定环境下自组装成病毒样颗粒。
[0005]病毒样颗粒(Virus
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like Particles，VLPs)也称核心样颗粒(Core
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like Particles，CLPs)，是由病毒结构蛋白组装而成的介于于15nm～400nm的空心颗粒。VLPs不
含病毒基因组，不能自主复制，在形态上与真正病毒粒子相似，可通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞，有效诱导机体产生免疫保护反应。
[0006]目前，研究报道的用于表达病毒样颗粒的主要是昆虫细胞表达系统，但其生产成本较高。相比之下，原核表达系统蛋白表达量高，生产成本低，生产操作简单，但在实际操作中，多数蛋白由于不能正确折叠而形成包涵体，为后续的研究工作及应用带来障碍。

技术实现思路

[0007]设计目的：通过构建重组质粒，利用大肠杆菌分别与四种分子伴侣共表达VP2蛋白并获得病毒样颗粒，从而为猫细小病毒新型疫苗提供可靠的思路和方法。
[0008]设计方案：为实现上述设计目的。本申请：(1)通过大肠杆菌的密码子偏爱性，人工修饰合成猫细小病毒VP2的基因序列。(2)将修饰后猫细小病毒VP2基因插入pUC载体中，得到pUC
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VP2，将所述pUC
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VP2载体和pET30a载体分别经限制性内切酶NdeⅠ和HindⅢ双酶切后经T4连接酶连接，得到表达载体。(3)将表达载体和四种分子伴侣pG
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KJE7、pG
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KJE8、pGro7和pTf16共同转化入ER2566细胞中，得到重组菌。(4)分别将四种重组表达菌体进行诱导表达，4种菌株培养液中均加入终浓度为2mg/mLL
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阿拉伯糖和终浓度为0.2mmol/LIPTG的诱导剂，ER2566
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pET30a
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VP2
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pKJE8菌株培养液中加入终浓度为20ng/mL四环素的诱导剂，25℃下诱导16h后收集菌体。(5)将得到的菌体与裂解液混合后进行冰浴超声破碎，将得到的超声物离心，得到的沉淀为猫细小病毒VP2蛋白。(6)经过不同种纯化方法制备得到的猫细小病毒VP2蛋白置于组装液中进行组装，获得的病毒样颗粒的直径优选为24nm，此病毒样颗粒具有类似于天然细小病毒的大小、形状和血凝性，血凝效价能达到2
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。
[0009]所述猫细小病毒VP2基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，具体如下所示：
[0010]ATGAGCGATGGTGCGGTGCAACCGGATGGTGGCCAACCGGCGGTGCGTAACGAACGTGCGACCGGCAGCGGTAACGGCAGCGGTGGCGGTGGCGGTGGCGGTAGCGGCGGTGTGGGTATCAGCACCGGCACCTTTAACAACCAAACCGAGTTTAAGTTCCTGGAAAACGGTTGGGTTGAGATTACCGCGAACAGCAGCCGTCTGGTGCACCTGAACATGCCGGAGAGCGAAAACTACAAACGTGTGGTTGTGAACAACATGGACAAGACCGCGGTTAAAGGCAACATGGCGCTGGACGATACCCACGTTCAGATCGTGACCCCGTGGAGCCTGGTTGACGCGAACGCGTGGGGTGTGTGGTTCAACCCGGGCGATTGGCAGCTGATCGTTAACACCATGAGCGAACTGCACCTGGTGAGCTTTGAGCAAGAAATTTTCAACGTTGTGCTGAAAACCGTTAGCGAGAGCGCGACCCAGCCGCCGACCAAAGTGTACAACAACGACCTGACCGCGAGCCTGATGGTTGCGCTGGATAGCAACAACACCATGCCGTTTACCC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猫细小病毒VP2基因，其特征在于，所述猫细小病毒VP2基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。2.一种表达载体，其特征在于，将权利1要求所述的细小病毒VP2基因插入到载体中，得到表达载体。3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述载体包括pET30a载体。4.一种重组菌，其特征在于，将权利要求2或3所述的表达载体、四种分子伴侣质粒共同转化入ER2566细胞中，得到重组菌。5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述表达载体与分子伴侣质粒的质量比为0.5～1.5:0.5～1.5。6.一种猫细小病毒VP2蛋白的可溶性表达方法，其特征在于：猫细小病毒VP2蛋白与四种分子伴侣蛋白pG
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KJE7、pG
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KJE8、pGro7和pTf16共同表达。7.根据权利要求4或5所述的重组菌，其特征在于，所述分子伴侣包括pG
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KJE7、pG
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KJE8、pGro7和pTf16质粒。8.一种制备猫细小病毒VP2蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将权利要求4～6任...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵林烨，王博，夏霖亚，吴丛梅，殷玉和，
申请(专利权)人：长春工业大学，
类型：发明
国别省市：