一种用于定量的同位素标记的完整蛋白的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种用于定量的同位素标记的完整蛋白的制备方法及其应用，制备方法包括以下步骤：重组质粒的制备；重组蛋白的表达；蛋白性能验证；蛋白纯化；蛋白纯度检测；蛋白定量。还包括同位素标记的完整蛋白的应用。本发明专利技术使用的

【技术实现步骤摘要】
一种用于定量的同位素标记的完整蛋白的制备方法及其应用


[0001]本专利技术属于完整蛋白制备
，具体涉及一种用于定量的同位素标记的完整蛋白的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]蛋白质常被用作临床诊断标记物，其检测量值的大小往往标志着疾病的严重程度，常用的检测方法有酶联免疫吸附法、免疫发光法和免疫投射比浊法等。由于各厂家针对不同的目标物开发的方法和试剂不同，测量结果单位的不统一等问题，造成测量的偏差很大。
[0003]目前同位素稀释质谱法是蛋白质溯源到SI单位应用最广泛的方法，而同位素标记物作为内标是蛋白质溯源中关键一环。然而由于技术限制，目前蛋白质只能通过同位素标记的氨基酸和同位素标记的肽段进行溯源，同位素标记的氨基酸只适用于纯品蛋白，因为血清等复杂基质中的杂质蛋白也会水解成氨基酸，从而干扰蛋白质的定量。因此，同位素标记的肽段成为血清基质目标蛋白定量的首选，其中在样品处理过程中用到胰蛋白酶，它是将目标蛋白酶解为可以测量的肽段，但是这一过程又会引入酶切效率这一不可控因素，直接影响蛋白质的定量。
[0004]最直接的方法就是利用同位素标记的完整蛋白来对目标蛋白定量，因为酶切效率可以无差别地应用于两种蛋白，从而减少试验误差。但是由于技术等原因，市面上很少有同位素标记的完整蛋白，目前有Sigma公司研制的同位素标记的C反应蛋白，但是该样品浓度低，价格高，且是特定氨基酸上的碳氮被同位素标记的碳氮替代，存在酶切后特征肽段上没有同位素标记的碳氮的问题。
[0005]因此，同位素标记的内标蛋白的缺失是直接导致许多临床检测蛋白无法溯源的原因，这使得大量的蛋白质缺乏相关的标准物质。
[0006]本项目通过研制一种基于基因克隆的同位素标记蛋白质的生产、纯化方法，开发一种同位素标记的完整蛋白质的溯源方法，并将定值结果溯源至SI单位。从而为各大计量机构研发标准物质，以及企业试剂盒生产开发质控品提供技术支持。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种用于定量的同位素标记的完整蛋白的制备方法及其应用，该同位素标记的完整蛋白质与非标记的完整蛋白只存在碳元素价位的不同，非标记的蛋白质是常规碳源
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C，而同位素标记的完整蛋白将所有的
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C换成了
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C。该同位素标记的完整蛋白可以用于对血清中蛋白质的定量，由于两者结构相同，试验带来的偏差能无差别的应用于两种蛋白，因此是一种高效、简便、可靠的检测方法。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种用于定量的同位素标记的完整蛋白的制备方法，包括以下步骤：S1：重组质粒的制备：将目标基因插入到载体中，转染感受态，得到重组的含有目
标基因的菌株；S2：重组蛋白的表达：将上述重组的含有目标基因的菌株扩大培养，当培养到设定的OD值后加入IPTG诱导表达，收集菌株并裂解，收集上清和沉淀；S3：蛋白性能验证：使用检测试剂盒检测同位素标记的完整蛋白的活性，接着用飞行时间高分辨串联质谱系统检测目标蛋白的分子量；S4：蛋白质纯化：使用蛋白纯化仪对蛋白质纯度进行纯化；S5：蛋白纯度检测：采用SDS
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Page电泳法和液相色谱法进行蛋白质纯度验证；S6：蛋白定量：使用同位素稀释质谱法对蛋白质进行定量分析，将蛋白质水解为氨基酸，选择三个氨基酸作为定量标记物，使用氨基酸标准物质对其进行定量分析，以三者平均值作为绝对定量的结果。
[0009]优选的是，在步骤S1中，具体操作为将表达目标蛋白的基因优化，插入到质粒pET30a中，将重组质粒pET30a
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PCT转入表达菌种感受态细胞BL21，热激后涂布在含有卡那霉素的平板上，37℃过夜培养，其中平板中卡那霉素的浓度为50 μg/mL。
[0010]上述任一方案中优选的是，在步骤S2中，具体操作为挑取单克隆菌株到2 mL含有抗生素的M9液体培养基中（用
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C标记葡萄糖取代普通葡萄糖）进行第一次增菌，37℃过夜培养；次日，取0.2 mL第一次增菌液按照1:50接入到10 mL的M9培养基中（用
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C标记葡萄糖取代普通葡萄糖）进行第二次增菌，37℃过夜培养；接着取第二次增菌液10 mL再以1：50扩大接入到500 mL的M9培养基中（用
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C标记葡萄糖取代普通葡萄糖），37℃培养至OD
600
=0.6，加入0.8 mM的IPTG，25℃过夜诱导表达，8000 rpm、4℃离心5 min，收集菌体；加80 mL破碎液进行超声波裂解；裂解条件：温度冰浴、功率60 %、超声2 s、间隔2 s、时间40 min。12000 rpm、4℃离心40 min，收集上清和沉淀。
[0011]上述任一方案中优选的是，在步骤S3中，所述蛋白活性检测具体方法为，将制备好的同位素标记的完整蛋白用1%的碳酸氢铵稀释到浓度约为50 ng/mL，取100 μL滴加到配套的试纸条上，等待15 min后，使用快速检测仪对其进行快速检测，并记录测得值。
[0012]上述任一方案中优选的是，在步骤S3中，所述目标蛋白完整分子量检测中，制备样品浓度为1 mg/mL，色谱柱为ACQUITY UPLC Pepdide BEH C4柱；以0.1%甲酸水为水相和以0.1%甲酸乙腈为有机相；流速0.2 mL/min，进样量2 uL。
[0013]上述任一方案中优选的是，在步骤S4中，所述标记蛋白的纯化，先根据重组蛋白上自带的His
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tag标签与镍琼脂糖凝胶有很好的亲和力，使用镍柱对其进行纯化。再使用蛋白纯化仪对经镍柱纯化后的蛋白进行二次纯化，使用SEC（体积排阻色谱）柱根据蛋白质分子量的大小进行分离，并收集主峰；再使用离子交换柱依据蛋白表面所带电荷量不同进行蛋白分离，对SEC柱纯化后的蛋白进行再次纯化。
[0014]上述任一方案中优选的是，在步骤S5中，所述SDS
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Page电泳法的具体操作为在目标蛋白溶液中加入适量上样缓冲液混匀，90℃加热5 min；泳道中加入Marker和样品，电压调到80 V；之后将胶块用考马斯亮蓝染色，20 min后用洗脱液反复洗脱，直至能看到条带。
[0015]上述任一方案中优选的是，在步骤S5中，所述液相色谱法检测蛋白质的纯度的操作为以0.1%的甲酸水作为水相，以0.1%的甲酸已经作为有机相，用梯度洗脱的方式，使用全扫描模式找到相应最高的波长。
[0016]上述任一方案中优选的是，在步骤S6中，所述同位素稀释质谱法的操作为将100 μ
L的同位素标记的完整蛋白溶液分装到安瓿瓶中，加入等量的氨基酸标准物质，混匀后放离心浓缩仪中，50℃，浓缩1 h；加入500 μL，6 M的盐酸，充高纯氮气2 min后封口；样品在110℃水解48 h；打开盖子，通入高纯氮吹干；用200 μL 0.1%乙腈水溶液溶解，并用0.22 μm的滤膜过滤；质谱进样量为2 μL。
[0017]上述制本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于定量的同位素标记的完整蛋白的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：S1：重组质粒的制备：将目标基因插入到载体中，转染感受态，得到重组的含有目标基因的菌株；S2：重组蛋白的表达：将所述重组的含有目标基因的菌株扩大培养，当培养到设定的OD值后加入IPTG诱导表达，收集菌株并裂解，收集上清和沉淀；S3：蛋白性能验证：使用检测试剂盒检测同位素标记的完整蛋白的活性，接着用飞行时间高分辨串联质谱系统检测目标蛋白的分子量；S4：蛋白质纯化：使用蛋白纯化仪对蛋白质纯度进行纯化；S5：蛋白纯度检测：采用SDS
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Page电泳法和液相色谱法进行蛋白质纯度验证；S6：蛋白定量：使用同位素稀释质谱法对蛋白质进行定量分析，将蛋白质水解为氨基酸，选择三种氨基酸作为定量标记物，使用氨基酸标准物质对其进行定量分析，以三者平均值作为绝对定量的结果。2.根据权利要求1所述的一种用于定量的同位素标记的完整蛋白的制备方法，其特征在于：在步骤S1中，具体操作为将表达目标蛋白的基因优化，插入到质粒pET30a中，将重组质粒pET30a
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PCT转入表达菌种感受态细胞BL21，热激后涂布在含有卡那霉素的平板上，37℃过夜培养，其中，所述平板中卡那霉素的浓度为50 μg/mL。3.根据权利要求1所述的一种用于定量的同位素标记的完整蛋白的制备方法，其特征在于：在步骤S2中，具体操作为挑取单克隆菌株到2 mL含有抗生素的M9液体培养基中，用
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C标记葡萄糖取代普通葡萄糖，进行第一次增菌，37℃过夜培养；次日，取0.2 mL第一次增菌液按照1:50接入到10 mL的M9培养基中，用
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C标记葡萄糖取代普通葡萄糖，进行第二次增菌，37℃过夜培养；接着取第二次增菌液10 mL再以1：50扩大接入到500 mL的M9培养基中，用
13
C标记葡萄糖取代普通葡萄糖，37℃培养至OD
600
=0.6，加入0.8 mM的IPTG，25℃过夜诱导表达，8000 rpm、4℃离心5 min，收集菌体，加80 mL破碎液进行超声波裂解，裂解条件：温度冰浴、功率60 %、超声2 s、间隔2 s、时间40 min、12000 rpm、4℃离心40 min，收集上清和沉淀。4.根据权利要求1所述的一种用于定量的同位素标记的完整蛋白的制备方法，其特征在于：在步骤S3中，所述蛋白活性检测具体方法为，将制备好的同位素标记的完整蛋白用1%的碳酸氢铵稀释到浓度约为50 ng/mL，取100 μL滴加到配套的试纸条上，等待15 min后，使用快速检测仪对其进行快速检测，并记录测得值。5.根据权利要求1所述的一种用于定量的同位素标记的完整蛋白的制备方法，其特征在于：在步骤S3中，所述目标蛋白完整分子量检测中，制备样品浓度为1 mg/mL，色谱柱为ACQUITY UPLC Pepdide BEH C4柱；以0.1%甲酸水为水相和以0.1%甲酸乙腈为有机相；流速0.2 mL/min，进样量2 uL。6.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈鸿飞，朱文，燕茹，惠文珊，陈琳，张雨晨，范宇宸，倪鑫茹，朱杰，朱慧，
申请(专利权)人：南京市计量监督检测院，
类型：发明
国别省市：