【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及化合物生物技术及发酵工程技术生产领域，尤其是一种生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌及其构建方法与应用。
技术介绍
1、2’-脱氧腺苷作为脱氧核糖核苷的一种，参与了几乎参与所有生物细胞的遗传信息的传递，影响着蛋白质的合成以及多糖的代谢，并对生物体内细胞的生长、增殖、分化和抑制等具有十分重要的调控作用。它不但是基因药物与基因工程研究的重要原材料，而且它还自身具有很好的生理活性，2’-脱氧腺苷可抑制由糖诱导的胰岛素释放，并且能够降低特异性磷酸二脂酶抑制剂或腺苷环化酶激活剂对于胰岛素分泌的促进作用。此外，2’-脱氧腺苷还可作为抗病毒、抗癌、抗艾滋病药物的重要中间体。
2、目前合成2’-脱氧腺苷的方法有水解法、化学合成法和生物催化法。水解法通过水解含有dna的原料来制备2’-脱氧腺苷，该方法具有原料供应不稳定和分离过程复杂的缺点。化学合成法以腺苷为底物经酯化，酰化剂和缚酸剂的酰化作用，再通过还原和纯化处理得到2’-脱氧腺苷，其缺点为对设备的要求高，产率较低、反应步骤繁琐，反应条件苛刻，且反应时间较长。目前报导的生物催化法以腺嘌呤为前体物，过表达嘌呤核苷磷酸化酶（ deod）、尿苷磷酸化酶（ udp）和硫脒磷酸化酶（ deoa）基因，实现了2’-脱氧腺苷的合成，该方法的缺点为前体物价格昂贵，产量普遍很低，存在耗时长、产率低等问题，很难实现工业化生产。
3、微生物发酵法已经被作为大多数天然小分子产物大规模
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌。
2、本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供上述生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌的构建方法。
3、本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供上述生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌的应用。
4、为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：
5、一种生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌，为菌株dar-09，是通过下述基因改造方法获得的：首先通过在出发菌株 e.coliw3110的基因组 yjiv位点引入异源的 b.subtilis168菌株嘌呤操纵子基因 pur( ekbcsqlfmnhd)，由ptrc启动子启动，得到菌株dar-01；然后在基因组 yghx、ygay位点引入异源的 b. subtilis168菌株腺苷酸琥珀酸合酶基因 pura和腺苷酸琥珀酸裂解酶基因 purb，分别由pt7启动子、ptrc启动子启动，并分别得到菌株dar-02、dar-03；然后敲除腺苷脱氨酶基因 add、嘌呤核苷磷酸化酶 deod、黄嘌呤碱磷酸化酶 xapa、核苷二磷酸激酶基因 ndk，阻断分解途径，分别得到菌株dar-04、dar-05、dar-06、dar-07；然后在基因组ycgh位点双拷贝5'-脱氧核苷酸酶基因 yfbr和腺苷酸激酶基因 adk，由pt7启动子启动得到菌株dar-08；最后导入pet-28a(+)-t4-nrdbca质粒，得到改造成功后的目的菌株dar-09。
6、优选的，上述生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌，所述出发菌株是野生型 e.coliw3110（atcc 273250）。
7、优选的，上述生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌，所述嘌呤操纵子基因 pur( ekbcsqlfmnhd)、腺苷酸琥珀酸合酶基因 pura和腺苷酸琥珀酸裂解酶基因 purb均来自于腺苷工程菌株 b. subtilis168（atcc 23857），其中，所述嘌呤操纵子基因 pur( ekbcsqlfmnhd)的核苷酸序列如seq id no.1所示（ncbi-geneid分别为： pure：939481； purk：936039； purb：936048； purc：939389； purs：936041； purq：938760； purl：939233； purf：936046； purm：936044； purn：936045； purh：936053； purd：938741）；所述腺苷酸琥珀酸合酶基因 pura的核苷酸序列如seq id no.2所示（ pura；ncbi-geneid：935805）；所述腺苷酸琥珀酸裂解酶基因 purb的核苷酸序列如seq id no.3所示（ purb；ncbi-geneid：936048）。
8、优选的，上述生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌，所述腺苷脱氨酶基因 add的核苷酸序列如seq id no.4所示（ add；ncbi-geneid：945851）；所述嘌呤核苷磷酸化酶 deod的核苷酸序列如seq id no.5所示（ deod；ncbi-geneid：945654）；所述黄嘌呤碱磷酸化酶 xapa的核苷酸序列如seq id no.6所示（ xapa；ncbi-geneid：946878）；所述核苷二磷酸激酶 ndk的核苷酸序列如seq id no.7所示（ ndk；ncbi-geneid：945611）。
9、优选的，上述生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌，所述5'-脱氧核苷酸酶基因 yf本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌，其特征在于：是通过下述基因改造方法获得的：首先通过在出发菌株E.coliW3110的基因组yjiV位点引入异源的B.subtilis 168菌株嘌呤操纵子基因pur(EKBCSQLFMNHD)，由Ptrc启动子启动，得到菌株dAR-01；然后在基因组yghX、ygaY位点引入异源的B. subtilis 168菌株腺苷酸琥珀酸合酶基因purA和腺苷酸琥珀酸裂解酶基因purB，分别由PT7启动子、Ptrc启动子启动，并分别得到菌株dAR-02、dAR-03；然后敲除腺苷脱氨酶基因add、嘌呤核苷磷酸化酶deoD、黄嘌呤碱磷酸化酶xapA、核苷二磷酸激酶基因ndk，阻断分解途径，分别得到菌株dAR-04、dAR-05、dAR-06、dAR-07；然后在基因组ycgH位点双拷贝5'-脱氧核苷酸酶基因yfbR和腺苷酸激酶基因adk，由PT7启动子启动得到菌株dAR-08；最后导入pET-28a(+)-T4-nrdBCA质粒，得到改造成功后的目的菌株。
2.根据权利要求1所述的生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌，其特征在于：所述嘌呤操纵子基因
3.根据权利要求1所述的生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌，其特征在于：所述质粒pET-28a(+)-T4-nrdBCA，以pET-28a(+)质粒为骨架，携带硫酸卡那霉素抗性基因和由PT7启动子表达的噬菌体埃希氏菌体T4 nrdBCA基因，所述pET-28a(+)质粒的核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示。
4.根据权利要求1所述的生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌，其特征在于：所述硫酸卡那霉素抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示,所述噬菌体埃希氏菌体T4 nrdBCA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
5.根据权利要求1所述的生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌，其特征在于：所述Ptrc启动子具有序列表SEQ ID NO.12所示核苷酸序列，PT7启动子具有序列表SEQ ID NO.13所示核苷酸序列。
6.权利要求1-5之一所述生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：
7.权利要求1-5之一所述生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌在生产2’-脱氧腺苷方面的应用。
8.根据权利要求7所述的生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌的应用，其特征在于：通过发酵罐培养的方法获得2’-脱氧腺苷。
9.根据权利要求8所述的生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌的应用，其特征在于：所述发酵罐培养的具体方法为：
10.根据权利要求9所述的生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌的应用，其特征在于：采用的种子培养基为：葡萄糖30g/L，酵母浸粉6g/L，蛋白胨4g/L，柠檬酸1g/L，(NH4)2SO4 3g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，KH2PO41.5g/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，MnSO45mg/L，Vb1、Vb 3、Vb 5、Vb 12各2mg/L，VH 1mg/L，硫酸卡那霉素50mg/L，其余为水；采用的发酵培养基为：葡萄糖30g/L，酵母浸粉6g/L，蛋白胨2g/L，柠檬酸2g/L，(NH4)2SO4 3g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，KH2PO44g/L，FeSO4·7H2O 20mg/L，MnSO4 10mg/L，Vb1、Vb 3、Vb 5、Vb 12各2 mg/L，VH 1 mg/L，硫酸卡那霉素50mg/L，其余为水。
...【技术特征摘要】
1.一种生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌，其特征在于：是通过下述基因改造方法获得的：首先通过在出发菌株e.coliw3110的基因组yjiv位点引入异源的b.subtilis 168菌株嘌呤操纵子基因pur(ekbcsqlfmnhd)，由ptrc启动子启动，得到菌株dar-01；然后在基因组yghx、ygay位点引入异源的b. subtilis 168菌株腺苷酸琥珀酸合酶基因pura和腺苷酸琥珀酸裂解酶基因purb，分别由pt7启动子、ptrc启动子启动，并分别得到菌株dar-02、dar-03；然后敲除腺苷脱氨酶基因add、嘌呤核苷磷酸化酶deod、黄嘌呤碱磷酸化酶xapa、核苷二磷酸激酶基因ndk，阻断分解途径，分别得到菌株dar-04、dar-05、dar-06、dar-07；然后在基因组ycgh位点双拷贝5'-脱氧核苷酸酶基因yfbr和腺苷酸激酶基因adk，由pt7启动子启动得到菌株dar-08；最后导入pet-28a(+)-t4-nrdbca质粒，得到改造成功后的目的菌株。
2.根据权利要求1所述的生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌，其特征在于：所述嘌呤操纵子基因pur(ekbcsqlfmnhd)的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述腺苷酸琥珀酸合酶基因pura的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述腺苷酸琥珀酸裂解酶基因purb的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述腺苷脱氨酶基因add的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述嘌呤核苷磷酸化酶deod的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述黄嘌呤碱磷酸化酶xapa的核苷酸序列如seq id no.6所示；所述核苷二磷酸激酶ndk的核苷酸序列如seq id no.7所示；所述5'-脱氧核苷酸酶基因yfbr的核苷酸序列如seq id no.8所示；所述腺苷酸激酶基因adk的核苷酸序列如seq id no.9所示。
3.根据权利要求1所述的生产2’-脱氧腺苷的基因工程菌，其特征在于：所述质粒pet-28a(+)-t4-nrdbca，以pet-28a(+)质粒为骨架，携带硫酸卡那霉素抗性...
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