【技术实现步骤摘要】
本申请涉及基因检测，尤其是涉及一种检测基因融合的靶向建库方法。
技术介绍
1、基因融合是由于基因组重排导致两个相距较远的基因连接在一起，形成一个嵌合基因(也叫融合基因)。发生基因融合时，一个基因的启动子及其5’端（上游）的编码序列与另一个基因的3’端(下游)编码序列以及3’utr组合在一起，导致下游基因的表达受其受其上游基因的启动子调控。
2、基因融合在肿瘤细胞中经常发生导致很多原本不表达或低表达的基因在异位启动子的调控下高表达，反之亦然。很多由于融合导致的异常基因表达可以作为药物的靶点。例如，在非小细胞肺癌中，alk发生基因融合后的异常表达可指导阿来替尼的用药；而ros1发生融合后的异常表达可指导克里佐替尼的用药。因此，确定是否存在特定的基因融合事件对肿瘤的靶向治疗具有重要的指导意义。
3、目前，在二代测序水平上，用于检测基因融合的方法可分为两类。一种是基于dna的，衍生的方法包括全基因组测序（wgs）和靶向二代测序（ngs）。两者都是通过在测序后，寻找基因融合点两侧的read作为证据来识别融合的。另一种是基于rna的，相应的方法包括转录组测序以及靶向rna测序，通过寻找嵌合转录本来对融合事件进行识别。
4、 我们的专利技术涉及使用rna测序来检测基因融合。目前常用的方法有两种：方法1.根据已知融合形成的转录本进行成对引物设计，扩增潜在的融合rna转录本，形成ngs文库，然后进行测序，如thermofisher的ampliseq 系列产品采用的就是这种方法。由于该方法是针对基因已知融合序列来
5、为了克服此缺点，我们专利技术了一种新的方法，该方法既可以检测未知融合，又不依赖于连接酶进行建库。增强了检测能力的同时，又简化了建库流程。
技术实现思路
1、为了解决即可以检测融合基因，但又不依赖于连接酶的问题，本申请提供了一种检测未知基因融合的靶向建库方法。
2、第一方面，一种检测基因融合的靶向建库方法，包括如下步骤：
3、逆转录：采用随机引物逆转录目标rna，得到第一cdna链；
4、第二链合成：使用所述随机引物扩增所述第一cdna链，得到第二cdna链；
5、建库：对第二cdna链进行pcr得到dna文库；
6、其中，所述随机引物为含有测序接头片段的随机设计的引物。
7、在一些实施方式中，逆转录步骤中采用的rna聚合酶可以为amv逆转录酶、m-mlv逆转录酶或其他常用的逆转录酶中的任意一种；第二链合成的步骤中所采用的的dna聚合酶可以为bst3dna聚合酶、klenow，taq或其他常用的dna聚合酶中的任意一种。
8、通过采用上述技术方案，在逆转录以及第二条链合成这两个步骤中使用序列相同的带测序接头的随机引物进行转录，使得在第二条链合成后被测序的dna双端就已经带上测序接头，本申请的建库方法无需通过传统方法中的连接酶进行dna链接反应添加测序接头，从而大大地简化了实验的步骤和时间，提高了建库效率。
9、 优选的，所述随机引物的序列为seq id no.1。
10、优选的，所述建库步骤中，pcr为锚定pcr。
11、优选的，所述建库步骤中，pcr中所用的引物为单端特异性引物。
12、通过采用上述技术方案，普通pcr在引物设计过程中，必须知道模板序列，即序列必须已知，因此只能检测已知融合。而本申请采用一端为通用的测序接头引物，另一端非特异性引物作为pcr的引物，除了能检测已融合的基因外，还能检测未知的融合基因。
13、优选的，所述随机引物序列中至少2个碱基t被替换或修饰为高保真dna聚合酶无法识别的碱基序列。
14、优选的，所述随机引物序列中至少2个碱基t被替换为碱基u。
15、 优选的， 锚定pcr中使用高保真dna聚合酶。
16、通过采用上述技术方案，随机引物中将至少两个碱基t替换为u，从而在pcr的过程中，抑制全基因组的扩增，提高靶向扩增产物的比率，大大提高在靶率。
17、第二方面，一种检测基因融合的靶向建库检测方法，对已知融合基因检测文库进行测序，获得已知融合基因的序列。
18、第三方面，一种用于检测基因融合的靶向建库产品，所述产品含有随机引物。
19、第四方面，一种检测基因融合的靶向建库检测方法，一种对已知融合基因检测文库进行测序，获得已知融合基因的序列的检测方法，或产品在融合基因检测中的应用。
20、综上所述，本申请具有如下有益效果：
21、1. 通过在逆转录以及第二条链合成两个步骤中使用同样的带接头的随机引物，本申请在第二条链合成后dna双端就已经带上二代测序接头，而不需依赖额外的连接酶进行dna链接反应后加上接头，大大简化实验步骤。
22、 2. 本申请在融合基因检测中仅需要使用单端特异性引物，另一端是通用的接头引物，除可检测已知融合基因外，还可检测未知融合基因。
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1.一种检测基因融合的靶向建库方法，其特征在于，包括如下步骤：
2. 根据权利要求1所述的一种检测基因融合的靶向建库方法，其特征在于，所述随机引物的序列为SEQ ID No.1。
3.根据权利要求1所述的一种检测基因融合的靶向建库方法，其特征在于，所述随机引物序列中至少2个碱基T被替换或修饰为高保真DNA聚合酶无法识别的碱基序列。
4.根据权利要求3所述的一种检测基因融合的靶向建库方法，其特征在于，所述随机引物序列中至少2个碱基T被替换为碱基U。
5.一种检测基因融合的建库检测方法，包含使用权利要求1-4任一项所述的检测基因融合的靶向建库方法，对已知融合基因检测文库进行测序，获得已知融合基因的序列。
6.一种检测基因融合的靶向建库检测方法，包含使用权利要求1-4任一项所述的检测基因融合的靶向建库方法，对未知融合基因检测文库进行测序，获得未知融合基因的序列。
7.一种用于检测基因融合的靶向建库产品，其特征在于，所述产品含有权利要求1-4任一项中所述的随机引物。
8.权利要求1-4任一项所述的方法，权
...【技术特征摘要】
1.一种检测基因融合的靶向建库方法，其特征在于，包括如下步骤：
2. 根据权利要求1所述的一种检测基因融合的靶向建库方法，其特征在于，所述随机引物的序列为seq id no.1。
3.根据权利要求1所述的一种检测基因融合的靶向建库方法，其特征在于，所述随机引物序列中至少2个碱基t被替换或修饰为高保真dna聚合酶无法识别的碱基序列。
4.根据权利要求3所述的一种检测基因融合的靶向建库方法，其特征在于，所述随机引物序列中至少2个碱基t被替换为碱基u。
5.一种检测基因融合的建库检测方法，...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈敬臣，梁颖欣，覃庆玲，蔡兴盛，李梦真，邓泱泱，杨冬成，
申请(专利权)人：广州迈景基因医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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