一种利用光热材料光热效应快速扩增制造技术

本发明专利技术公开一种利用光热材料光热效应快速扩增

【技术实现步骤摘要】
一种利用光热材料光热效应快速扩增mecA抗性基因的光热环介导等温扩增方法


[0001]本专利技术涉及一种快速扩增
β
‑
内酰胺类抗生素抗性基因
mecA
的光热环介导等温扩增方法，属于分析检测

。

技术介绍

[0002]抗生素抗性基因是导致细菌产生抗生素耐药性的“元凶”，它是自然存在的
、
编码抵抗抗生素功能的基因片段，因其具备生物活性
、
迁移转化途径复杂
、
种类多样等特点，被视作一种新型环境污染物
。
抗性基因受人类活动影响，环境中抗生素选择压力持续存在，抗性基因在环境中的丰度不断升高，从而导致耐药微生物的“肆虐”。
其中，
β
‑
内酰胺类抗生素抗性基因是能使细菌产生对
β
‑
内酰胺类抗生素的抗性的一类抗性基因，随环境
、
食品跨宿主跨地区传播，造成食品安全风险，同时导致临床治疗中抗菌药物的选择受限，严重威胁人类健康
。
因此，迫切需要开发
β
‑
内酰胺类抗生素抗性基因的现场快速检测方法
。
[0003]等温扩增技术可以在恒定温度下进行扩增反应，在体外实现扩增目的核酸片段，相较于聚合酶链式反应技术
(PCR)
不需要依赖热循环仪
。
其中，环介导等温扩增在
60
～
65℃
的恒温条件下
40
～
45min
即可实现目标基因片段扩增，且灵敏度较高，广泛应用于核酸扩增领域检测各类目标物
。
[0004]光热扩增，也称光子扩增，通过将各种光热纳米材料加入扩增体系中，用激光或发光二极管
(LED)
等作为光源，区别于传统的介质浴，热源与扩增体系直接接触，实现体积加热，核酸扩增提供所需的能量
。Jalili
等介绍了一种基于金纳米薄膜的微流控芯片和等离子体光热循环器的快速液滴光子
PCR
系统，在
13
分钟内实现
30
个从
60℃
到
95℃
的热循环
(Sci Rep 2021,11,23338)
，
Liu
等引入苯胺
(TPP)
修饰的
Au
纳米粒子
(Au
‑
TPP)
作为加热元件来提高原位滚环扩增
(RCA)
的特异性，用于直接原位检测
mRNA(Biosensors and Bioelectronics 2021,192
，
113507)
，光子扩增降低了能耗，缩短了操作时间，提高了扩增效率，已与
PCR
，
LAMP
，
RCA
扩增技术联用，并显示出良好的效果，是一种很有前途的现场检测平台
。
目前尚未有利用光热扩增技术检测抗生素抗性基因的报道
。

技术实现思路

[0005]技术问题：
[0006]现有
mecA
抗性基因环介导等温扩增方法具有以下局限性：依赖水浴
、
金属浴等不易携带设备；扩增时间较长，扩增效率有待提高
。
[0007]技术方案：
[0008]本专利技术的第一个目的是，提供一种利用光热材料光热效应快速扩增
mecA
抗性基因的光热环介导等温扩增的方法，光热环介导等温扩增体系包括以下组分：引物组
、
可可粉提取物及
DNA
模板，利用
808nm
激光光源照射激发可可粉提取物的光热效应进而以高效率体积加热方式提供环介导等温扩增所需温度，实现等温扩增体系中
mecA
抗性基因的环介导等温
扩增
。
[0009]作为一种可选的实施方式，所述可可粉提取物由可可粉进行脱脂
、
研磨预处理后得到
。
[0010]进一步的作为一种可选的实施方式，所述脱脂包括使用正戊烷萃取脱脂，所述研磨后的可可粉颗粒粒径不低于
30
目
。
[0011]作为一种可选的实施方式，所述光热环介导等温扩增体系中，可可粉提取物以浓度为
100mg/mLDEPC
水的可可粉提取物溶液的形式加入
。DEPC
水是用
DEPC(diethyl pyrocarbonate
，焦碳酸二乙酯
)
处理过并经高温高压灭菌的超纯水
(
一级水
)
，无色液体
。
经检测不含杂质
RNA、DNA
和蛋白质
。DEPC
水可以用于
RNA
沉淀的溶解，含有
RNA
的各种反应体系如反转录
、siRNA
的退火等，以及其它各种要求无
RNase、DNAase
和
proteinase
的反应体系
。
[0012]作为一种可选的实施方式，所述可可粉提取物溶液在该光热环介导等温扩增体系中的体积浓度为4％～8％
v/v。
[0013]作为一种可选的实施方式，所述
DNA
模板是指含目标基因的基因组
DNA
，所述基因组
DNA
的提取方法包括
DNA
提取试剂盒提取法
、
吸附柱法
、
磁珠法
、CTAB
法任意一种
。
[0014]作为一种可选的实施方式，所述光热环介导等温扩增体系中，
DNA
模板的浓度为4％
v/v。
[0015]作为一种可选的实施方式，所述引物组包括两个外部引物
F3
和
B3、
两个内部引物
FIP
和
BIP
，及两个环引物
loop F
和
loop B。
[0016]作为一种可选的实施方式，所述光热环介导等温扩增体系中，两个外部引物
F3
和
B3
的浓度为4％
v/v
，两个内部引物
FIP
和
BIP
的浓度为2％～
10
％
v/v
，两个环引物
loop F
和
loop B
的浓度为0～4％
v/v。
[0017]作为一种可选的实施方式，所述光热环介导等温扩增体系还包括以下组分：
BSA、MgSO4、Thermo Pol
缓冲液
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种利用光热材料光热效应快速扩增
mecA
抗性基因的光热环介导等温扩增的方法，其特征在于，光热环介导等温扩增体系包括以下组分：引物组
、
可可粉提取物及
DNA
模板，所述可可粉提取物由可可粉经脱脂
、
研磨预处理后得到，利用
808nm
激光光源照射激发可可粉提取物的光热效应进而以体积加热方式提供环介导等温扩增所需温度，实现等温扩增体系中
mecA
抗性基因的环介导等温扩增
。2.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脱脂包括使用正戊烷萃取脱脂，所述研磨后的可可粉颗粒粒径为不低于
30
目
。3.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光热环介导等温扩增体系中，可可粉提取物以浓度为
100mg/mLDEPC
水的可可粉提取物溶液的形式加入，其中，可可粉提取物溶液在该光热环介导等温扩增体系中的体积浓度为4％～8％
v/v。4.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述
DNA
模板是指含目标基因的基因组
DNA
，所述基因组
DNA
的提取方法包括
DNA
提取试剂盒提取法
、
吸附柱法
、
磁珠法
、CTAB
法任意一种
。5.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光热环介导等温扩增体系中，
DNA
模板的浓度为4％
v/v。6.
根...

【专利技术属性】
技术研发人员：张毅，黄晴，王朝晖，邱艺超，苏耀斌，王文龙，沈晓芳，严秀平，
申请(专利权)人：多麦福建食品有限公司，
类型：发明
国别省市：