基于制造技术

本发明专利技术公开了一种基于

【技术实现步骤摘要】
基于P
‑
ERCA的赭曲霉毒素A可视化检测方法及试剂盒


[0001]本专利技术涉及一种赭曲霉毒素
A
的检测方法，具体涉及一种基于挂锁式指数级滚环扩增
(P
‑
ERCA)
的赭曲霉毒素
A
可视化检测方法及试剂盒，属于生化检测

。

技术介绍

[0002]赭曲霉毒素
A(OTA)
广泛存在于被霉菌污染的大麦
、
玉米
、
燕麦和大豆等农作物中，当动物摄入了霉变的饲料后，赭曲霉毒素
A
会在动物体内积累并随着被加工咸肉制品后，进入人体进而侵害肝脏和肾脏，同时还对人体的免疫力造成损害
。
由于赭曲霉毒素
A
在真菌毒素中的毒性最强
、
分布最广
、
与人类健康关系最密切，所以具有高灵敏度的
OTA
微量检测方法对监测动物饲料质量安全以及保护人类健康具有重大的意义
。
[0003]目前检测粮食和饲料中赭曲霉毒素
A
的仪器方法主要有仪器法和试纸条法
。
其中仪器法包括高效液相色谱法
、
气相色谱法
、
质谱法和荧光光度法等，这些方法灵敏度较高，结果稳定可重复，但所需仪器较昂贵且样品前处理步骤繁琐，耗时时间长，不适用于大量待测样品的现场检测，限制了其应用
。
试纸条法主要为测流向试纸条法，其实际上主要应用了免疫法的原理，即采用抗原抗体的高特异性对赭曲霉毒素
A
进行检测，但制备抗体所需时间长且价格昂贵，难以满足现场检测所需的低成本
、
高通量等要求
。

技术实现思路

[0004]本专利技术的主要目的是提供一种基于
P
‑
ERCA
的赭曲霉毒素
A
可视化检测方法，其具有成本低
、
操作便捷
、
灵敏度高
、
特异性好和检测时间短等优点，从而克服现有技术的不足
。
[0005]本专利技术还提供了一种基于
P
‑
ERCA
的赭曲霉毒素
A
可视化检测试剂盒
。
[0006]本专利技术的一个方面提供了一种基于
P
‑
ERCA
的赭曲霉毒素
A
可视化检测方法，其包括：
[0007]S1、
使修饰在赭曲霉毒素
A
适配体上的第一修饰物与固定在固相载体的第二修饰物特异性结合，之后使所述赭曲霉毒素
A
适配体与经过亲和力及竞争释放能力筛选后的单链
DNA
引物杂交结合，获得第一液相反应体系；
[0008]S2、
在所述第一液相反应体系中加入赭曲霉毒素
A
，并使赭曲霉毒素
A
与所述赭曲霉毒素
A
适配体特异性结合，以使至少部分的所述单链
DNA
引物与所述赭曲霉毒素
A
适配体分离，并游离于液相反应体系中，从而获得第二液相反应体系；
[0009]S3、
从所述第二液相反应体系中分离出上清液，并基于所述上清液构建挂锁式指数级滚环扩增反应体系，再进行挂锁式指数级滚环扩增，获得含有目标
DNA
的第三液相反应体系；
[0010]S4、
以修饰有显色标记的信号探针和固定有检测探针的试纸条对所述第三液相反应体系进行检测，从而实现对赭曲霉毒素
A
的可视化检测，其中所述信号探针
、
检测探针的核苷酸序列分别与所述目标
DNA
的部分核苷酸序列互补
。
[0011]本专利技术的另一个方面提供了一种基于
P
‑
ERCA
的赭曲霉毒素
A
可视化检测试剂盒，
其包括赭曲霉毒素
A
适配体
、
单链
DNA
引物
、
挂锁式指数级滚环扩增反应组件
、
修饰有显色标记的信号探针和试纸条等；所述挂锁式指数级滚环扩增反应组件包括
DNA
连接酶
、
脱氧核苷酸三磷酸
、DNA
聚合酶和挂锁式模板探针；所述试纸条的检测线
、
质控线上分别固定有检测探针
、
质控探针
。
[0012]相较于现有技术，本专利技术利用指数级滚轮扩增将信号进行放大，并首次与试纸条相结合，实现了赭曲霉毒素的高灵敏和可视化检测，其具有成本低
、
操作便捷
、
灵敏度高
、
特异性好和检测时间短等优点
。
附图说明
[0013]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍
。
[0014]图1是本专利技术的一些实施例中一种赭曲霉毒素
A
可视化检测方法的原理图；
[0015]图2是本专利技术一实施例中一种赭曲霉毒素
A
可视化检测方法的可行性测试结果；
[0016]图3是本专利技术一实施例中一种赭曲霉毒素
A
可视化检测方法的灵敏度测试结果；
[0017]图4是本专利技术一实施例中一种赭曲霉毒素
A
可视化检测方法的特异性测试结果；
[0018]图5是本专利技术一实施例中与赭曲霉毒素适配体互补的不同单链
DNA
引物的
OTA
竞争值测试图
。
具体实施方式
[0019]针对现有赭曲霉毒素
A
检测技术上的不足，本案专利技术人经长期研究和大量实践，得以提出本专利技术的技术方案，其主要是一种基于挂锁式指数级滚环扩增和金标试纸条可视化检测赭曲霉毒素
A
的方法，该方法的特异性好
、
灵敏度高
、
操作简便且检测成本低，符合现场快速检测的要求
。
如下将对该技术方案
、
其实施过程及原理等作进一步的解释说明
。
[0020]在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术，但是，本专利技术还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施，因此，本专利技术的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制
。
[0021]本专利技术的一些实施例提供的一种基于
P
‑
ERCA
的赭曲霉毒素
A
可视化检测方法包括：
[0022]S1、
使修饰在赭曲霉毒素
A
适配体上的第一修饰物与固定在固相载体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种基于
P
‑
ERCA
的赭曲霉毒素
A
可视化检测方法，其特征在于，包括：
S1、
使修饰在赭曲霉毒素
A
适配体上的第一修饰物与固定在固相载体的第二修饰物特异性结合，之后使所述赭曲霉毒素
A
适配体与单链
DNA
引物杂交结合，获得第一液相反应体系；
S2、
在所述第一液相反应体系中加入赭曲霉毒素
A
，并使赭曲霉毒素
A
与所述赭曲霉毒素
A
适配体特异性结合，以使至少部分的所述单链
DNA
引物与所述赭曲霉毒素
A
适配体分离，并游离于液相反应体系中，从而获得第二液相反应体系；
S3、
从所述第二液相反应体系中分离出上清液，并基于所述上清液构建挂锁式指数级滚环扩增反应体系，再进行挂锁式指数级滚环扩增，获得含有目标
DNA
的第三液相反应体系；
S4、
以修饰有显色标记的信号探针和固定有检测探针的试纸条对所述第三液相反应体系进行检测，从而实现对赭曲霉毒素
A
的可视化检测，其中所述信号探针
、
检测探针的核苷酸序列分别与所述目标
DNA
的部分核苷酸序列互补
。2.
根据权利要求1所述的可视化检测方法，其特征在于，所述赭曲霉毒素
A
适配体的核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示；所述单链
DNA
引物的核苷酸序列如
SEQ ID NO.2
所示
。3.
根据权利要求1所述的可视化检测方法，其特征在于，所述挂锁式指数级滚环扩增反应体系还包含
DNA
连接酶
、
脱氧核苷酸三磷酸
、DNA
聚合酶和挂锁式模板探针
。4.
根据权利要求3所述的可视化检测方法，其特征在于，所述挂锁式模板探针的5′
端修饰有磷酸基团，且所述挂锁式模板探针的核苷酸序列中有三个切刻内切酶酶切位点
。5.
根据权利要求3或4所述的可视化检测方法，其特征在于，所述挂锁式模板探针的核苷酸序列如
SEQ ID NO.3<...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈伟，王师沂，陈琦，姚丽，吴倩，姚帮本，陈赵然，陆华进，
申请(专利权)人：合肥工业大学，
类型：发明
国别省市：