色氨酸合酶及其突变体在生产半胱氨酸和胱氨酸中的应用制造技术

本发明专利技术涉及色氨酸合酶及其突变体在生产半胱氨酸和胱氨酸中的应用，对来源于

【技术实现步骤摘要】
色氨酸合酶及其突变体在生产半胱氨酸和胱氨酸中的应用


[0001]本专利技术涉及
L
‑
半胱氨酸和
L
‑
胱氨酸的酶催化合成方法，属于基因工程和酶工程

。

技术介绍

[0002]L
‑
半胱氨酸和
L
‑
胱氨酸是含硫的非必需氨基酸，是组成各种蛋白质的基本单元之一，在人类和动物的毛发及指爪等的角蛋白中含量较高
。L
‑
半胱氨酸和
L
‑
胱氨酸广泛用于医药
、
食品
、
化妆品
、
饲料等的加工制造，尤其可以替代价格更高的甲硫氨酸作为饲料添加剂而使用，因此具有广阔的市场需求和前景
。
目前，工业生产
L
‑
胱氨酸的主要采用化学水解法，以人或动物的毛发经酸水解或碱水解后提纯制取
。
该方法产量低
、
能耗高
、
原料受限，并且水解过程产生难闻气体及大量的废酸废碱，对环境影响较大
。
基于上述问题，采用微生物发酵法和体外酶催化法等绿色环保的方法生产胱氨酸和半胱氨酸已成为人们研究和关注的方向
。
[0003]微生物发酵法生产
L
‑
半胱氨酸和
L
‑
胱氨酸是微生物在细胞内利用丝氨酸乙酰转移酶（
CysE
）和半胱氨酸合酶（
CysK
和
CysM
）催化丝氨酸和硫辛烷基（
‑
SH
供体）生成
L
‑
半胱氨酸，
L
‑
半胱氨酸通过氧化转换成
L
‑
胱氨酸
。
该方法生产成本低
、
对环境友好
、
不受原料限制，工业化生产前景广阔
。
但由于微生物体内半胱氨酸合成途径复杂且
‑
SH
的来源问题尚未得到彻底解决，因此发酵法生产半胱氨酸目前仍然仅停留在实验室阶段，距工业化大规模生产尚有距离
。
[0004]体外酶催化法是通过工程菌株表达所需的催化酶，处理后得到的酶或酶液在体外催化丝氨酸和硫氢化物反应生成半胱氨酸；反应结束后进行氧化处理，将
L
‑
半胱氨酸氧化为
L
‑
胱氨酸；再利用
L
‑
胱氨酸在水中溶解度极低
、
易于沉淀的特性，从反应液中分离得到较高纯度的
L
‑
胱氨酸粗品
。
体外酶催化法具有工艺简单
、
副产物少
、
易于纯化等优点，发展前景十分广阔
。
[0005]色氨酸合酶（
Tryptophan synthase
，
Trps
）由
β
‑
亚基（
TrpB
）和
α
‑
亚基（
TrpA
）两个亚基组成，是生物体内色氨酸合成途径中的关键酶，催化吲哚与丝氨酸反应合成色氨酸
。
研究发现，来源于大肠杆菌的色氨酸合酶（
EcTrps
）不仅具有合成色氨酸的功能，还能够催化丝氨酸和硫氢化钠生成半胱氨酸，这为半胱氨酸的酶催化生产开辟了新思路
。
迄今为止，除大肠杆菌的色氨酸合酶外，尚无其他种类的色氨酸合酶（
Trps
）被报道同样具有催化丝氨酸和硫氢化钠生成半胱氨酸的功能
。EcTrps
属于常温酶，在高温下容易失活
。
[0006]目前酶催化生产
L
‑
半胱氨酸和
L
‑
胱氨酸主要是以
EcTrps
为催化酶，催化底物丝氨酸和硫氢化钠合成半胱氨酸，半胱氨酸再经氧化形成胱氨酸
。
为了简化工艺
、
降低成本，酶催化法通常是将表达
EcTrps
的工程菌株的细胞培养物高压破碎后得到的粗酶液作为酶源参与催化反应
。
使用粗酶液进行催化，虽然省略了酶的提纯和
/
或固定化步骤，工艺简单
、
成本低廉，但是却会增加
L
‑
胱氨酸粗品中菌体蛋白等杂质的量，不利于后续的进一步纯化和精制
。
另外，粗酶液富含多种菌体蛋白和培养基等营养成分，这也使得反应体系存在较高的
染菌风险，从而影响酶催化反应的正常进行
。
因此，希望寻找一种既可以使用粗酶液作为酶源又可以不增加反应体系的染菌风险并且提高
L
‑
胱氨酸粗品纯度的酶催化生产方法
。

技术实现思路

[0007]为了降低酶催化法生产
L
‑
胱氨酸过程中的染菌风险，同时也为了提高
L
‑
胱氨酸粗品纯度
。
本专利技术对不同物种来源的色氨酸合酶（
Trps
）进行筛选，发现来源于超嗜热菌
Pyrococcus furiosus
的色氨酸合酶（
PfTrps
）具有非常好的高温热稳定性，且具备催化丝氨酸和硫氢化钠合成
L
‑
半胱氨酸的活性（本专利技术后述所涉及酶活
、
酶活性
、
反应酶活
、
酶功能
、
催化功能等或具有相同含义的类似表述，如未特殊说明，均指催化丝氨酸和硫氢化钠合成
L
‑
半胱氨酸的活性或功能）
。
对表达
PfTrps
的生产菌株的细胞破碎液进行高温处理，
PfTrps
由于具有良好的热稳定性不会发生沉淀，而大部分不耐高温的菌体蛋白等杂质蛋白则会在高温下变性沉淀，过滤去除沉淀得到基本不含杂质蛋白的
PfTrps
粗酶液，作为酶源催化丝氨酸和硫氢化钠生成
L
‑
半胱氨酸，可以大大降低反应过程中的染菌风险，并且还减少了最终
L
‑
胱氨酸粗品中杂质的含量
。
[0008]本专利技术提供一种耐高温的色氨酸合酶，其是来源于
Pyrococcus furiosus
的
PfTrps
，包括
α
‑
亚基（
PfTrpA
，
Uniplot ID Q8U094
）和
β
‑
亚基（
PfTrpB
，
Uniplot ID Q8U093
）两个亚基，能够催化丝氨本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种色氨酸合酶突变体，其特征在于，由
α
‑
亚基和
β
‑
亚基组成，其中
α
‑
亚基的氨基酸序列如
SEQ ID NO
：2所示，
β
‑
亚基是以
SEQ ID NO
：1所示的氨基酸序列为基础，进行选自如下位点的突变：第
275
位组氨酸突变为苯丙氨酸或第
301
位酪氨酸突变为苯丙氨酸，所述突变体能够催化丝氨酸和硫氢化钠生成
L
‑
半胱氨酸
。2.
一种如权利要求1所述的色氨酸合酶突变体用于制备
L
‑
半胱氨酸或
L
‑
胱氨酸的用途
。3.
一种
L
‑
半胱氨酸或
L
‑
胱氨酸的制备方法，其特征在于，使用如权利要求1所述的色氨酸合酶突变体
。4.
一种如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）培养表达如权利要求1所述色氨酸合酶突变体的重组微生物；（2）对培养物进行细胞破碎处理；（3）对细胞破碎物进行高温处理；（4）离心，得到的上清液即为含有所述色氨酸合酶突变体的粗酶液；（5）使用所述粗酶液催化丝氨酸和硫氢化钠反应合成
L
‑
半胱氨酸；如需制备
L
‑
胱氨酸，则所述制备方法还进一步包括：（6）对
L
‑
半胱氨酸进行氧化处理得到
L
‑
胱氨酸；（7）过滤得到
L
‑
胱氨酸粗品
。5.
一种来源于
Pyrococcus furiosus
的色氨酸合酶
PfTrps
用于制备
L
‑
半胱氨酸或
L
‑
胱氨酸的用途，所述
PfTrps
包括
PfTrpA
和
PfTrpB
两个亚基， 所述
PfTrpA
的氨基酸序列如
SEQ ID NO
：2所示，所述
PfTrpB
的氨基酸序列如
SEQ ID NO
：1所示，所述色氨酸合酶
PfTrps
能够催化丝氨酸和硫氢化钠生成
L
‑
半胱氨酸
。6.
一种如权利要求5所述的用...

【专利技术属性】
技术研发人员：林振泉，乔玮博，马成伟，刘云慧，金祥，
申请(专利权)人：北京量维生物科技研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：