用于酶催化生产胞苷酸的基因工程改造菌株和方法技术

本发明专利技术公开了一种用于酶催化生产胞苷酸的基因工程改造菌株和方法，以胞苷作为底物，三磷酸腺苷/腺苷直接或间接为磷酸供体，在多酶体系催化条件下生物合成胞苷酸。为了消除副产物并提高转化效率，通过基因敲除技术对大肠杆菌中影响胞苷酸合成的多个内源酶基因进行了敲除，利用得到的大肠杆菌突变菌株表达胞苷合成胞苷酸所需酶系，使用表达后的粗酶液作为酶源直接用于胞苷酸的酶催化生产，不仅能够达到提高产量和转化率、减少副产物生成的目的，还有效降低了生产成本。还有效降低了生产成本。还有效降低了生产成本。

【技术实现步骤摘要】
用于酶催化生产胞苷酸的基因工程改造菌株和方法


[0001]本专利技术涉及胞苷酸的酶催化法合成方法，属于基因工程和酶工程


技术介绍

[0002]胞苷酸参与构成核酸，广泛应用于核酸类药物前体以及食品添加剂等不同领域。目前生产胞苷酸主要有RNA水解法、化学合成法、生物合成法。RNA水解法会产生除胞苷酸外的其它3种核苷酸，下游的分离纯化较为困难。化学合成法通常以三氯氧磷为磷酸供体，将核苷直接磷酸化生成相应核苷酸，但该方法反应条件剧烈，产生的废物污染环境，不适合绿色生产。生物合成法又包括微生物发酵法以及酶催化法。微生物发酵法是以葡萄糖为原料，利用微生物直接发酵生产胞苷酸。该方法虽然具有成本低、工艺简单和批量生产等优点，但同时也存在产物成分复杂、下游分离困难以及发酵废水污染环境等缺点。酶催化法是以胞苷为底物，采用酶催化的方法合成胞苷酸。相较于其他方法，该方法反应条件更温和、产物成分更简介、污染更小，具有易于操作、易于控制、易于提取、生产周期短等诸多优势，有着较大的生产潜力。
[0003]酶催化法生产胞苷酸，是利用胞苷为底物，以三磷酸腺苷（ATP）为磷酸供体，在尿苷胞苷激酶（UCK）的催化作用下生成胞苷酸的反应过程（参见图1）。为简化操作降低成本，尿苷胞苷激酶（UCK）的来源通常使用大肠杆菌表达菌株的粗酶液。但是一般的大肠杆菌表达菌株粗酶液中除所表达的尿苷胞苷激酶外，同时还含有大量影响胞苷酸积累的内源酶。这些内源酶直接影响反应体系中胞苷向胞苷酸的定向转化以及产物胞苷酸的积累并产生较多的副产物（例如尿苷酸、胞嘧啶、胞苷二磷酸等），从而导致胞苷酸的产量、产率以及转化率难以提高，不仅造成了底物的浪费，而且加大了纯化的难度，从而难以简化工艺、降低生产成本。
[0004]另外，利用尿苷胞苷激酶（UCK）催化生产胞苷酸的反应中，三磷酸腺苷（ATP）作为磷酸供体失去一个磷酸基团成为二磷酸腺苷（ADP）。由于三磷酸腺苷（ATP）价格昂贵，如果在反应体系中直接使用ATP作为磷酸供体，则会大大增加生产成本，不利于大规模生产。

技术实现思路

[0005]为解决酶催化法生产胞苷酸过程中由于相关内源酶的存在导致的副产物多、产量和转化率低等问题，本专利技术提供一种用于酶催化生产胞苷酸的突变菌株。通过基因敲除技术，对核苷二磷酸糖焦磷酸酶基因ushA进行了敲除，抑制了胞苷催化合成胞苷酸的逆反应，防止生成的胞苷酸通过逆反应转化为胞苷；对嘧啶特异性核糖核酸水解酶基因rihA和嘧啶特异性核糖核酸水解酶基因rihC进行了敲除，阻止了胞苷到胞嘧啶的转化，从而促进胞苷合成胞苷酸的反应；对环鸟苷酸激酶基因cmk进行了敲除，阻止了合成的胞苷酸向胞苷二磷酸的转化，有利于反应体系中胞苷酸的积累；对胞苷脱氨酶基因cdd进行了敲除，阻止了胞苷到尿苷的转化，从而促进胞苷合成胞苷酸的反应。所得到的突变菌株
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ΔushAΔrihA ΔrihC Δcmk Δcdd有效减少了影响胞苷酸积累的内源酶，使用其过表达催化胞苷生成胞苷
酸的尿苷胞苷激酶（UCK）以及催化ADP重新磷酸化为ATP的聚磷酸激酶（PPK），利用上述突变菌株表达的粗酶液作为酶源，酶催化胞苷合成胞苷酸，有效降低胞嘧啶、尿苷、胞苷二磷酸等副产物的含量，并且大大提高了胞苷酸的产量和转化率。
[0006]另外，由于直接在酶催化反应体系中添加ATP作为磷酸供体存在成本过高的问题。本专利技术进一步提供一系列改进的用于酶催化生产胞苷酸的突变菌株，在上述突变菌株
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ΔushA ΔrihA ΔrihC Δcmk Δcdd的基础上，进一步敲除腺苷脱氨酶add基因，阻止腺苷到肌酐的转化，得到突变菌株
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ΔushA ΔrihA ΔrihC Δcmk ΔcddΔadd。该突变菌株进一步减少内源酶腺苷脱氨酶的表达，可以使用价格较低的腺苷作为原料合成ATP。在此基础上，再过表达催化胞苷生成胞苷酸的尿苷胞苷激酶（UCK）以及催化腺苷合成ATP的聚磷酸激酶（PPK）、腺苷激酶（ADO）和腺苷酸激酶（ADK），利用其表达的粗酶液催化腺苷合成ATP以及催化胞苷合成胞苷酸，不仅成功降低了副产物的含量，还提高了胞苷酸的产量和转化率，而且还有效降低了成本。
[0007]本专利技术提供一种用于表达胞苷酸合成酶系的突变菌株，其特征在于敲除了大肠杆菌基因组上的核苷二磷酸糖焦磷酸酶基因ushA、嘧啶特异性核糖核酸水解酶基因rihA、嘧啶特异性核糖核酸水解酶基因rihC、环鸟苷酸激酶基因cmk、胞苷脱氨酶基因cdd。
[0008]在上述突变菌株的基础上，还可以敲除腺苷脱氨酶add基因。
[0009]所述突变株，还可以分别过表达催化胞苷生成胞苷酸的尿苷胞苷激酶（UCK）、催化腺苷合成ATP的聚磷酸激酶（PPK）、腺苷激酶（ADO）或腺苷酸激酶（ADK）。
[0010]本专利技术提供一种用于胞苷酸合成的酶液，其特征在于使用上述突变菌株发酵生产所述酶液。
[0011]本专利技术提供一种突变菌株、酶液在生产胞苷酸中的用途。
[0012]本专利技术提供一种胞苷酸的合成方法，其使用上述任一突变菌株、上述酶液合成胞苷酸。该合成方法使用上述任一所述菌株经诱导表达后，菌株经细胞破碎后所得，粗酶液不做处理直接用于胞苷酸的合成。该合成方法的反应液组成为：磷酸氢二钠、胞苷、硫酸镁、六偏磷酸、三磷酸腺苷、UCK反应酶液、PPK反应酶液。上述合成方法的反应液组成为：磷酸氢二钠、胞苷、硫酸镁、六偏磷酸、腺苷、UCK反应酶液、PPK反应酶液、ADO反应酶液、ADK反应酶液。
[0013]下面更为具体地对本专利技术的方案做进一步阐述。
[0014]本专利技术提供一种用于酶催化生产胞苷酸的突变菌株，其是将大肠杆菌的对核苷二磷酸糖焦磷酸酶基因ushA、嘧啶特异性核糖核酸水解酶基因rihA、嘧啶特异性核糖核酸水解酶基因rihC、环鸟苷酸激酶基因cmk、胞苷脱氨酶基因cdd进行敲除后而得到的突变菌株
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ΔushAΔrihA ΔrihC Δcmk Δcdd。
[0015]本专利技术进一步提供一组用于酶催化生产胞苷酸的突变菌株，其是在上述突变菌株
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ΔushA ΔrihA ΔrihCΔcmk Δcdd的基础上，分别过表达催化胞苷生成胞苷酸的尿苷胞苷激酶（UCK）以及催化腺苷合成ATP的聚磷酸激酶（PPK）而得到的突变菌株
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ΔushA ΔrihAΔrihC Δcmk Δcdd
ꢀ‑
UCK和突变菌株
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ΔushA ΔrihAΔrihC Δcmk Δcdd
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PPK。将UCK和PPK分别单独在上述突变菌株中进行过表达，其目的是为了防止共表达可能带来的目标蛋白之间的相互干扰，以保证UCK和PPK均能够过量足量表达。
[0016]本专利技术提供一种酶催化生产胞苷酸的方法，利用上述突变菌株
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ΔushA ΔrihA ΔrihCΔcmk Δcdd
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UCK和突变菌株
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于表达胞苷酸合成酶系的突变菌株，其特征在于敲除了大肠杆菌基因组上的核苷二磷酸糖焦磷酸酶基因ushA、嘧啶特异性核糖核酸水解酶基因rihA、嘧啶特异性核糖核酸水解酶基因rihC、环鸟苷酸激酶基因cmk、胞苷脱氨酶基因cdd。2.如权利要求1所述的突变菌株，其特征在于进一步敲除腺苷脱氨酶add基因。3.如权利要求1所述的突变菌株，其特征在于突变菌分别过表达催化胞苷生成胞苷酸的尿苷胞苷激酶（UCK）、催化腺苷合成ATP的聚磷酸激酶（PPK）、腺苷激酶（ADO）或腺苷酸激酶（ADK）。4.一种用于胞苷酸合成的酶液，其特征在于使用权利要求1
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3任一所述的突变菌株发酵生产所述酶液。5.一种如权利要求1
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3任一所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：金祥，林振泉，李杰，乔玮博，朱银壮，刘云慧，
申请(专利权)人：北京量维生物科技研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：