磷脂酰甘油磷酸酶编码基因在发酵生产胞苷中的应用制造技术

本发明专利技术公开了磷脂酰甘油磷酸酶编码基因在发酵生产胞苷中的应用，借助

【技术实现步骤摘要】
磷脂酰甘油磷酸酶编码基因在发酵生产胞苷中的应用


[0001]本专利技术涉及基因工程及发酵工程
，具体地，涉及一株胞苷生产菌株的基因工程改造以及利用其发酵生产胞苷的方法
。

技术介绍

[0002]胞苷（
Cytidine
），又名胞嘧啶核苷，是人体和动植物体内
RNA
的结构组成部分，具有多种生理活性，在化妆品
、
食品
、
保健品和医药等诸多行业具有广泛应用
。
因此，随着胞苷的市场需求不断扩大，开发一种廉价的可规模化应用的生产工艺十分迫切
。
[0003]目前，胞苷的生产主要有三种方法：化学合成法
、RNA
酶水解法和微生物发酵生产法
。
其中化学合成法主要以胞嘧啶或尿苷为原料通过催化反应生产胞苷，但因反应条件苛刻
、
环境污染严重等问题存在一定局限性
。RNA
酶水解法合成胞苷则对原料具有较高的要求，并且存在工艺繁琐
、
成本较高等问题
。
利用微生物发酵法生产胞苷又分为添加前体物发酵法和直接发酵法，添加前体尿嘧啶在一定条件下可生产得到胞苷，但前体物质昂贵且产率较低；相比之下，微生物直接发酵法因其具有成本低
、
工艺简单
、
环境友好
、
适合批量生产等优点，更具吸引力和发展前景
。
[0004]自然条件下能够合成胞苷的微生物种类主要包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，但天然菌株合成胞苷的产量较低，无法满足大规模生产的需求
。
近些年来，为提高胞苷产量，常采用传统诱变的方法以及通过微生物代谢工程改造手段对胞苷生产菌株进行基因工程改造
。
但是，传统诱变的方法具有不确定性强
、
工作量大等缺陷
。
另外，由于微生物合成产物的过程中需要协调多个代谢中间物和代谢反应，而这些物质和反应同时还处于更加复杂庞大的细胞相互作用网络中，因此基于代谢工程的理性分子改造往往难以达到预期，具有一定的局限性
。
综上，目前胞苷的大规模工业提产依然存在瓶颈，有必要寻找突破胞苷代谢途径的新靶点，以期改善发酵法生产胞苷的产量和转化率等重要生产指标
。
[0005]CRISPR
干扰（
CRISPR interference
，
CRISPRi
）技术通过
dCas9
‑
sgRNA 复合物与目标
DNA
的靶向结合形成空间位阻抑制目标
DNA
的转录，形成对目标基因表达的抑制
。
该技术可用于快速筛选有益的敲低基因靶点，通常用于改善大肠杆菌和许多其他微生物宿主中所需产物的生物合成，作为一种很有前途的基因调控工具，为理性改造复杂的细胞代谢网络提供额外的潜在基因靶点，以增强所需产物的生物合成
。

技术实现思路

[0006]为了打破对胞苷生产菌株进行理性化分子改造所存在的局限性，同时也为了解决目前微生物直接发酵法生产胞苷的转化率和产量较低等问题，本专利技术借助
CRISPRi
技术对胞苷生产菌株中可能存在的非胞苷代谢途径中的潜在靶点基因进行筛选，选择碳代谢模块中的
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个基因作为目标基因，利用
CRISPRi
系统构建筛选体系，筛选出影响胞苷合成的非胞苷代谢途径的有效抑制靶点
pgpA
，
pgpB
和
pgpC。pgpA、pgpB、pgpC
这三个基因分别编码磷脂酰甘油磷酸酶
A、
磷脂酰甘油磷酸酶
B、
磷脂酰甘油磷酸酶
C
，催化磷脂酰甘油磷酸（
PGP
）转化
为磷脂酰甘油（
PG
），目前的研究均不能揭示或预测其与胞苷的生产和代谢之间的关联性
。
[0007]将大肠杆菌的
pgpA、pgpB、pgpC
基因分别抑制或敲除后得到的突变菌株
‑
Δ
pgpA、
突变菌株
‑
Δ
pgpB、
突变菌株
‑
Δ
pgpC
，其发酵生产胞苷的产量和转化率均得到较大提高
。
基于抑制或敲除筛选出的新靶点
pgpA、pgpB、pgpC
构建的胞苷生产菌株及利用其发酵生产胞苷的方法，突破了传统的理性化分子改造的局限性，为发酵法生产胞苷提供了新的思路
。
[0008]本专利技术提供一种抑制或敲除磷脂酰甘油磷酸酶编码基因用于改造微生物的用途，其特征在于促进胞苷的生产
。
[0009]本专利技术还提供一种通过抑制或敲除磷脂酰甘油磷酸酶编码基因促进微生物发酵生产胞苷的方法
。
[0010]所述磷脂酰甘油磷酸酶编码基因选自
pgpA、pgpB、pgpC。
[0011]所述微生物选自大肠杆菌或枯草芽孢杆菌
。
[0012]所述
pgpA
编码磷脂酰甘油磷酸酶
A
，
UniProt ID
：
P18200
；所述
pgpB
编码磷脂酰甘油磷酸酶
B
，
UniProt ID
：
P0A924
；所述
pgpC
编码磷脂酰甘油磷酸酶
C
，
UniProt ID
：
P0AD42。
[0013]本专利技术还提供一种用于发酵生产胞苷的突变菌株，其是将大肠杆菌的磷脂酰甘油磷酸酶编码基因抑制或敲除后而得到的，所述磷脂酰甘油磷酸酶编码基因选自
pgpA、pgpB、pgpC。
[0014]上述突变菌株中，优选对
pgpA、pgpB、pgpC
进行敲除而得到
。
[0015]所述
pgpA
编码磷脂酰甘油磷酸酶
A
，
UniProt ID
：
P18200
；所述
pgpB
编码磷脂酰甘油磷酸酶
B
，
UniProt ID
：
P0A924
；所述
pgpC
编码磷脂酰甘油磷酸酶
C
，
UniProt ID
：
P0AD42。
[0016]本专利技术还提供一种发酵生产胞苷的方法，使用上述突变菌株发酵制备胞苷
。
[0017]本专利技术提供一种磷脂酰甘油磷酸酶编码基因在利用大肠杆菌发酵生产胞苷中的应用，所述磷脂酰甘油磷酸酶编码基因选自大肠杆菌基因
pgpA、pgpB、pgpC。
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
抑制或敲除磷脂酰甘油磷酸酶编码基因用于改造微生物的用途，其特征在于促进胞苷的生产
。2.
如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述磷脂酰甘油磷酸酶编码基因选自
pgpA、pgpB、pgpC。3.
如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，微生物选自大肠杆菌或枯草芽孢杆菌
。4.
如权利要求1‑3任一所述的用途，其特征在于，所述
pgpA
编码磷脂酰甘油磷酸酶
A
，
UniProt ID
：
P18200
；所述
pgpB
编码磷脂酰甘油磷酸酶
B
，
UniProt ID
：
P0A924
；所述
pgpC
编码磷脂酰甘油磷酸酶
C
，
UniProt ID
：
P0AD42。5.
一种通过抑制或敲除磷脂酰甘油磷酸酶编码基因促进微生物发酵生产胞苷的方法，所述磷脂酰甘油磷酸酶编码基因选自
pgpA、pgpB、pgpC。6.
如权利要求5所述的方法，其特征在于，微生物选自大肠杆菌或枯草芽孢杆菌
。7.
如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述
pgpA
编码磷脂酰甘油磷酸酶
A
，...

【专利技术属性】
技术研发人员：金祥，林振泉，朱宇婷，李郭美慧，
申请(专利权)人：北京量维生物科技研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：