莽草酸脱氢酶突变体及利用其生产莽草酸的方法技术

本发明专利技术公开了莽草酸脱氢酶突变体及利用其生产莽草酸的方法，属于基因工程技术领域。本发明专利技术提供了莽草酸脱氢酶突变体，该突变体具有较高的催化3

【技术实现步骤摘要】
莽草酸脱氢酶突变体及利用其生产莽草酸的方法


[0001]本专利技术涉及莽草酸脱氢酶突变体及利用其生产莽草酸的方法，属于基因工程


技术介绍

[0002]莽草酸（Shikimic Acid，SA），化学名为3,4,5
‑
三羟基
‑1‑
环己烯
‑1‑
羧酸，分子式为C7H
10
O5，相对分子质量为174.15，是一种环己烷的羟基化不饱和酸衍生物。作为一种小分子有机酸，莽草酸在自然界中广泛存在。它不仅是微生物和植物合成叶酸、泛醌、维生素K2和芳香族氨基酸等芳香族化合物的中间体，也是工业生产中用于生产各种酚类、生物碱化合物及手性药物的关键原料。研究表明，莽草酸具有多种药用价值，莽草酸及其衍生物具有抗肿瘤、抗病毒、抗血栓、抗炎镇痛等多种生物活性。罗氏制药开发的用于治疗和预防禽流感的药物——磷酸奥司他韦（商品名：达菲）就是以莽草酸为主要原料生产的。
[0003]常规的莽草酸生产主要从八角茴香等植物中提取，除受产地、气候等原料供给的影响，从植物中提取莽草酸步骤繁多、提取工艺复杂、纯度不高，不能满足工业上对莽草酸的大量需求。
[0004]化学法合成莽草酸主要有Diels
‑
Alder反应法、逆Diels
‑
Alder反应法以及奎宁酸转化法等，它们虽然在产率及纯度上较植物提取法有明显的优势，但同样受限于原料供给、步骤复杂、反应条件苛刻、环境污染等问题。
[0005]莽草酸途径广泛存在于各类微生物中，利用微生物生产莽草酸具有操作工艺简单、生产周期短、生产成本低、经济效益高、便于大规模生产等优点。目前利用微生物发酵生产莽草酸主要通过构建莽草酸工程菌株实现的。以大肠杆菌莽草酸途径为例，参见附图1，初始底物葡萄糖经糖酵解途径和磷酸戊糖途径分别合成磷酸烯醇式丙酮酸（Phosphoenol Pyruvate，PEP）和4
‑
磷酸赤藓糖（Erythrose
‑4‑
phosphate，E4P）作为莽草酸合成的前体物质。随后两者缩合反应形成3
‑
脱氧
‑
D
‑
阿拉伯庚酮糖酸
‑7‑
磷酸（3
‑
Deoxy
‑
D
‑
arabino
‑
heptulosonate
‑7‑
phosphate，DAHP），进一步转化为3
‑
脱氢奎宁酸（3
‑
Dehydroquinic acid，DHQ），接着脱水反应形成3
‑
脱氢莽草酸（3
‑
Dehydroshikimic acid，DHS）。3
‑
脱氢莽草酸最终在莽草酸脱氢酶（AroE）的作用下消耗NADPH还原为莽草酸现有研究对大肠杆菌莽草酸合成途径的调控通常涉及对葡萄糖转运、中心碳代谢、莽草酸合成上游及下游的多环节改造，虽然大大提高了微生物发酵生产莽草酸的产量，但是却难以克服副产物3
‑
脱氢莽草酸的含量高的问题。
[0006]在大肠杆菌莽草酸途径中，莽草酸脱氢酶（AroE）催化的由3
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脱氢莽草酸还原生成莽草酸的反应是主要限速步骤之一。由于AroE同时还具有催化莽草酸逆向生成3
‑
脱氢莽草酸的活性，因此该反应是可逆反应。另外，随着发酵产物中莽草酸的积累，AroE还会受到莽草酸的反馈抑制，从而使得该反应向莽草酸的转化率受限。基于以上原因，利用大肠杆菌发酵生产莽草酸时发酵产物通常含有较高量的副产物3
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脱氢莽草酸，3
‑
脱氢莽草酸与莽草酸的比例通常在1：10以上。3
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脱氢莽草酸与目标产物莽草酸无论是分子量还是物理化学特性
均十分接近，这大大提高了莽草酸发酵生产过程中后续提纯与分离的难度，从而导致生成成本难以进一步降低。可见，降低发酵产物中副产物3
‑
脱氢莽草酸的含量，减少产物莽草酸对AroE的反馈抑制，这对微生物发酵大规模生产莽草酸来说是迫切要解决的问题。
[0007]现有AroE的最适pH通常在7左右，在此pH条件下，AroE具有较高的催化3
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脱氢莽草酸还原为莽草酸的活性，这对大规模发酵生产来说是必需的。但是在该pH条件下，AroE催化莽草酸逆向生成3
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脱氢莽草酸的活性并非最低，这使得发酵产物中副产物3
‑
脱氢莽草酸的含量难以得到更好的控制。虽然有研究表明，当降低pH时，AroE催化莽草酸逆向生成3
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脱氢莽草酸的活性会受到较多抑制，但是其催化3
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脱氢莽草酸还原生成莽草酸的活性也随之降低，这将导致在降低副产物的同时莽草酸的产量产率也受到影响。
[0008]另外，AroE之所以受到莽草酸的反馈抑制，来源于其对正向反应底物3
‑
脱氢莽草酸以及逆反应底物莽草酸的特异性结合的竞争。当发酵体系中产物莽草酸积累到较高浓度时，AroE被高浓度的莽草酸结合而无法结合正向反应底物3
‑
脱氢莽草酸而发挥正常的催化功能，进而限制了莽草酸的产量。因此，提高AroE对3
‑
脱氢莽草酸的结合特异性，有望降低这种产物反馈抑制的发生。
[0009]综上所述，希望找到一种更理想的AroE，其在一定条件下具有较高的催化3
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脱氢莽草酸还原生成莽草酸的活性以及较低的催化莽草酸逆向生成3
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脱氢莽草酸的活性，并且其对3
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脱氢莽草酸具有较高的结合特异性，从而增加莽草酸的积累并降低产物中杂质的含量。

技术实现思路

[0010]为解决现有的大肠杆菌莽草酸生产工程菌株3
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脱氢莽草酸转化为莽草酸的转化率低，不适用于工业化生产等缺陷，提供一种莽草酸脱氢酶AroE突变体及利用其发酵生产莽草酸的方法。通过对大肠杆菌野生型莽草酸脱氢酶AroE中重要的氨基酸位点进行突变，改变其最适pH及对3
‑
脱氢莽草酸的底物结合特异性，从而提高由3
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脱氢莽草酸生成莽草酸的正反应生成率，并降低副产物3
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脱氢莽草酸的含量。通过在生产莽草酸的大肠杆菌工程菌株中过表达所述莽草酸脱氢酶突变体，可强化大肠杆菌莽草酸脱氢酶催化3
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脱氢莽草酸生产莽草酸的代谢流，实现莽草酸的高效生产并显著降低副产物3
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脱氢莽草酸的含量。
[0011]本专利技术提供莽草酸脱氢酶突变体，所述突变体以SEQ ID NO：1所示氨基酸序列为基础，对其进行选自如下突变位点的突变：N59、D102、Q244，以降低莽草酸脱氢酶的最适pH，所述突变为上述突变位点中的一个或任意组合。
[0012]优选的，所述突变可选自N59D、D102N、Q244E。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.莽草酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体以SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列为基础，对其进行如下位点的突变： D102。2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变为D102N。3.如权利要求1或2任一项所述的突变体，其特征在于，还包括选自如下位点的突变：T61、K65、N86。4.如权利要求3所述的突变体，其特征在于，所述突变选自：T61R、T61N、T61D、T61E、K65H、K65N、N86D、N86L、N86W、N86E。5.如权利要求4所述的突变体，其特征在于，所述突变选自：D102N和T61R；D102N和T61N；D102N和T61D；D102N和T61E；D102N和K65H；D102N和K65N；D102N和N86D；D102N和N8...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔玮博，马成伟，王海雷，
申请(专利权)人：北京量维生物科技研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：