一种催化活性提高的12α-HSDH酶突变体及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种催化活性提高的12α

【技术实现步骤摘要】
一种催化活性提高的12
α
‑
HSDH酶突变体及其用途


[0001]本专利技术属于生物酶工程
，涉及一种12α
‑
HSDH酶突变体，尤其一种来源于梭菌属细菌Clostridium sp.AF15
‑
17LB菌株的12α
‑
HSDH酶突变体及其用途。

技术介绍

[0002]目前为止，合成熊去氧胆酸的方法依然不够成熟。在使用新型的酶法从胆酸合成熊脱氧胆酸的过程中，需要涉及到几种羟基类固醇脱氢酶HSDH(其中包括7α
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HSDH、7β
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HSDH、12α
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HSDH)。其中，12
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oxo
‑
鹅去氧胆酸(12
‑
oxo
‑
CDCA)是从胆酸出发合成鹅去氧胆酸(CDCA)的重要中间体，同时鹅去氧胆酸(CDCA)也是合成熊去氧胆酸的重要前体。12
‑
oxo
‑
鹅去氧胆酸是通过将胆酸的12位羟基氧化成羰基获得。对于胆酸12位羟基的氧化，传统的化学法常使用重金属氧化剂来进行，但使用该类方法生产的同时会对环境造成大量的污染，不符合当代可持续发展的理念。而12α
‑
羟基类固醇脱氢酶将胆酸12位羟基氧化为酮基，再用化学法合成鹅去氧胆酸，则具有反应条件温和、专一性高、减少化学污染等优点，非常适合应用于工业生产。
[0003]12α
‑
HSDH为研究最少也是研究最晚的酶类，目前有6组12α
‑
羟基类固醇脱氢酶(12α
‑
HSDH)的基因序列被报道，其中5组是来源于肠道的厌氧梭菌属，并且这一类酶均属于NADP依赖性。使用12α
‑
HSDH进行生产的一种重要影响因素是酶的活力，目前的12α
‑
HSDH还不够高，若能够找到一种具有更高酶活力的12α
‑
HSDH能够有效提高生产效率，降低生产成本。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于针对上述现有技术的不足之处而提供催化活性提高的12
[0005]‑
HSDH脱氢酶突变体及其应用。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种12α
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HSDH酶突变体，所述12α
‑
HSDH酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
[0007]本专利技术基于来源于Clostridium sp.AF15
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17LB 12α
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羟基类固醇脱氢酶(核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示)，通过蛋白结构模拟、定点饱和突变以及Rosetta辅助理性设计潜在影响酶活性的氨基酸位点。采用了定点突变策略对第101位丝氨酸进行饱和突变，构建突变体库并测序验证，筛选得到催化活性提高的突变体。与野生型12α
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HSDH脱氢酶相比，此12α
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HSDH脱氢酶突变体催化氧化效率更高，具有更好的工业应用前景。
[0008]本专利技术还要求保护所述的12α
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HSDH酶突变体的编码基因。
[0009]在本专利技术已提供了所述12α
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HSDH突变体的氨基酸序列的基础上，本领域技术人不难通过密码子的编码规则得到相应的编码基因序列。
[0010]作为本专利技术的优选实施方式，所述的12α
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HSDH酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
[0011]本专利技术进一步提供了上述编码基因的核苷酸序列，所述核苷酸序列可在一般的工程菌，包括大肠杆菌，毕赤酵母，链霉菌，枯草芽孢杆菌等中有效表达。
[0012]本专利技术还要求保护包含所述编码基因的重组表达载体。
[0013]在本专利技术已提供了所述12α
‑
HSDH突变体的核苷酸序列的基础上，本领域技术人不难将所述编码基因通过现有的基因工程方法接入相应的表达载体中。
[0014]作为本专利技术的优选实施方式，所述重组表达载体的载体骨架包括pET、pCW、pUC和pPIC9k中的其中一种。
[0015]本专利技术还要求保护包含所述编码基因的重组细胞。
[0016]将所述表达载体转化至合适的宿主细胞即可得到相应的用于表达目的蛋白的重组细胞。
[0017]作为本专利技术的优选实施方式，所述重组细胞采用的宿主细胞包括大肠杆菌、毕赤酵母、链霉菌和枯草芽孢杆菌中的其中一种。
[0018]进一步地，本专利技术还要求保护所述的12α
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HSDH氧化酶突变体，所述的编码基因，所述的重组表达载体，以及所述的重组细胞的用途。
[0019]作为本专利技术的优选实施方式，所述用途为用于制备12
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酮鹅去氧胆酸。
[0020]具体地，通过所述所述的编码基因，所述的重组表达载体，以及所述的重组细胞可得到所述12α
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HSDH氧化酶突变体，所述12α
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HSDH氧化酶突变体可参与胆酸12位羟基的氧化，得到12
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酮鹅去氧胆酸。
[0021]本专利技术还提供了一种制备12
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酮鹅去氧胆酸的方法，包括如下步骤：
[0022](1)将胆酸溶解于磷酸钠缓冲液中，并用液碱调节pH至8.0，
[0023](2)待底物完全溶解后加入NADP+和本专利技术所述的12α
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HSDH酶突变体、NOX，
[0024](3)30℃恒温水浴，搅拌24h。
[0025]本专利技术通过采用蛋白结构模拟技术、定点饱和突变以及Rosetta辅助对一种来源于梭菌属Clostridium sp.AF15
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17LB的辅酶NADP依赖型12α
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羟基类固醇脱氢酶进行定向突变改造，筛选得到活性显著提高的12α
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HSDH突变体，相较野生型单位酶活提高1.5倍，底物转化、生成率更好，对于提高12
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羰基鹅去氧胆酸的生产效率，对鹅去氧胆酸乃至熊去氧胆酸实现大量化生产具有重要意义。
具体实施方式
[0026]为更好的说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。
[0027]实施例中，未注明具体条件的实验方法，均按常规分子生物学实验方法操作，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础等译，第三版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行，或按照试剂盒生产商建议方法操作。
[0028]实施例1 12α
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HSDH酶突变体表达体系的构建
[0029](一)梭菌属Clostridium sp.AF15
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17LB的氧化还本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种12α
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HSDH酶突变体，其特征在于，所述12α
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HSDH酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。2.如权利要求1所述的12α
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HSDH酶突变体的编码基因。3.如权利要求1所述的12α
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HSDH酶突变体的编码基因，其特征在于，所述12α
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HSDH酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。4.包含如权利要求2或3所述编码基因的重组表达载体。5.如权利要求4所述重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体的载体骨架包括pET、pCW、pUC和pPIC9k中的其中一种。6.包含如权利要求2或3所述编码基因的重组细胞。7.如权利要求6所述的重...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟义华，张和平，卿宏，方灿龙，
申请(专利权)人：中山百灵生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：