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【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物酶工程,具体涉及一种醛酮还原酶akr1d1突变体及其编码基因和应用。
技术介绍
1、奥贝胆酸(obeticholic acid),化学名为3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸,属法尼醇x受体激动剂,通过活化法尼醇x受体,间接抑制细胞色素7a1(cyp7a1)的基因表达,从而可以抑制胆酸合成,用于治疗原发性胆汁性肝硬化和非酒精性脂肪性肝病。
2、目前,奥贝胆酸均是采用化学合成技术制备,例如:专利文献cn106749468a公开了一种奥贝胆酸的制备方法,该方法以猪去氧胆酸hdca为起始原料依次经过酯化反应、氧化反应、羟基保护反应、与乙基溴化锌或二乙基锌试剂反应、脱水反应、氧化反应、还原反应以及脱除羟基和羧基保护的反应得到奥贝胆酸。该方法不仅可以解决原材料问题,而且可以避免强碱性和高温等苛刻反应条件,大大提高了奥贝胆酸的合成效率,从而提供了一种副产物少,操作简便,反应条件温和,成本低廉,适于大规模生产奥贝胆酸的新制备方法。
3、专利文献cn108191939a公开了一种制备奥贝胆酸中间体及奥贝胆酸的方法,中间体的合成路线为:
4、
5、该奥贝胆酸中间体,在反应的过程中具有很好的立体选择性,极大地简化了奥贝胆酸的合成难度,降低了奥贝胆酸的合成成本。而且该方法使用的原料安全,成本低廉,有效降低了生产成本。
6、专利文献cn110938106a公开了一种制备奥贝胆酸中间体及其奥贝胆酸的方法,其中奥贝胆酸中间体以3a-羟基-6-乙烯基-7-氧代-胆烷酸为原料
7、然而,采用化学合成技术制备的奥贝胆酸或奥贝胆酸中间体,环保压力大,尤其是6-亚乙基中间体,如式i所示:
8、在进行还原得到奥贝胆酸时,需要进行选择性还原,手性试剂昂贵且有重金属残留。经检索发现,目前未有酶法制备奥贝胆酸或奥贝胆酸中间体的案例报道。
技术实现思路
1、为了解决现有技术的缺陷,本专利技术提供了一种醛酮还原酶akr1d1突变体及其编码基因和应用。该醛酮还原酶akr1d1(akr1d1)基因是生物体内还原胆酸类分子a环4,5-双键的一类酶,本专利技术通过蛋白质定向进化技术改变其催化的双键位置,将其从还原4,5-双键改造成可还原式i中间体的6位亚乙基不饱和双键,改造后的醛酮还原酶akr1d1突变体可以显著催化中间体1反应生成产物2,具有良好的工业化应用前景。具体反应如下所示:
2、
3、为解决上述技术问题,本专利技术提供以下技术方案:
4、来源于人类homo sapiens的野生型醛酮还原酶akr1d1的氨基酸序列如seq idno:2所示,其编码基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。
5、醛酮还原酶akr1d1的基因序列通过常州基宇生物技术有限公司合成所得,基因序列针对大肠杆菌的密码子偏好进行密码子优化,并在编码区两端分别添加ndei和hindiii限制性内切酶位点。目的基因片段通过限制性内切酶ndei和hindiii酶切后,与经过同样双酶切的pet28a(+)载体(novagen公司)进行连接、转化和筛选,筛选得到的阳性质粒akr1d1-pet28a(+)转入bl21(de3)宿主菌中,从而构建akr1d1的体外异源表达体系。
6、醛酮还原酶akr1d1突变体的构建,是通过定向进化的技术手段得到的。具体的为:利用易错pcr、dna重排、半理性设计及三维结构模拟等定向进行技术来获得突变体。更为具体的是:本专利技术利用能量最低原理和分子对接技术预测出可能的与催化相关的一个或多个活性位点,然后对这些活性位点进行定点突变,从中筛选出活性有显著提高的突变体。
7、进一步地,本专利技术通过分子对接技术预测出的潜在改变催化位置的位点为y132、w230、v309和l311,分别对这四个位点进行定点突变,利用高压液相色谱法(hplc)来进行突变体的筛选。更为具体的为,(1)当位点132的酪氨酸(y)突变为苯丙氨酸(f)时,突变体的催化活性相对于野生型酶来说得到了提高;(2)当位点230的色氨酸(w)突变为丙氨酸(a)时,突变体酶活相对野生型酶来说得到了提高;(3)当位点309的缬氨酸(v)突变为亮氨酸(l)时,突变体酶活相对野生型酶来说得到了提高;(4)当位点311的亮氨酸(l)突变为缬氨酸(v)时,突变体酶活得到了显著提高。当将上述4个位点的突变两两联合突变或三个联合突变或四个联合突变时,突变体的催化活性相对于单个突变体来说得到了更大的提高。
8、因此,本专利技术提供了一种醛酮还原酶akr1d1突变体,其氨基酸序列与氨基酸序列如seq id no:2所示的野生型醛酮还原酶akr1d1相比,在seq id no:2所示的氨基酸序列的第132位、第230位、第309位、第311位进行单突变、两两联合突变、三个联合突变或四个联合突变中的任意一种突变。
9、进一步地,所述醛酮还原酶akr1d1突变体的单突变为:
10、当seq id no:2所示的氨基酸序列的第132位由酪氨酸突变为苯丙氨酸,所述醛酮还原酶akr1d1突变体的氨基酸序列如seq id no:4所示;
11、或,当seq id no:2所示的氨基酸序列的第230位由色氨酸突变为丙氨酸,所述醛酮还原酶akr1d1突变体的氨基酸序列如seq id no:6所示;
12、或,当seq id no:2所示的氨基酸序列的第309位由缬氨酸突变为亮氨酸,所述醛酮还原酶akr1d1突变体的氨基酸序列如seq id no:8所示;
13、或,当seq id no:2所示的氨基酸序列的第311位由亮氨酸突变为缬氨酸,所述醛酮还原酶akr1d1突变体的氨基酸序列如seq id no:10所示。
14、进一步地,所述醛酮还原酶akr1d1突变体的三个联合突变为:
15、当seq id no:2所示的氨基酸序列的第132位由酪氨酸突变为苯丙氨酸,第309位由缬氨酸突变为亮氨酸,第311位由亮氨酸突变为缬氨酸,所述醛酮还原酶akr1d1突变体的氨基酸序列如seq id no:12所示。
16、进一步地,所述醛酮还原酶akr1d1突变体的四个联合突变为:
17、当seq id no:2所示的氨基酸序列的第132位由酪氨酸突变为苯丙氨酸,第230位由色氨酸突变为丙氨酸,第309位由缬氨酸突变为亮氨酸,第311位由亮氨酸突变为缬氨酸,所述醛酮还原酶akr1d1突变体的氨基酸序列如seq id no:14所示。
...【技术保护点】
1.一种醛酮还原酶AKR1D1突变体,其特征在于,所述醛酮还原酶AKR1D1突变体的氨基酸序列与氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的野生型醛酮还原酶AKR1D1相比,在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第132位、第230位、第309位、第311位进行单突变、两两联合突变、三个联合突变或四个联合突变中的任意一种突变。
2.根据权利要求1所述的醛酮还原酶AKR1D1突变体,其特征在于,所述单突变为:
3.根据权利要求1所述的醛酮还原酶AKR1D1突变体,其特征在于,所述三个联合突变为:
4.根据权利要求1所述的醛酮还原酶AKR1D1突变体,其特征在于,所述四个联合突变为:
5.权利要求2~4任一项所述的醛酮还原酶AKR1D1突变体的编码基因,其特征在于,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的醛酮还原酶AKR1D1突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQID NO:3所示;
6.含有权利要求5所述的编码基因的载体,其特征在于,所述载体为pET表达载体、pCW表达载体、pUC表达载体或pPIC9k表达载体。
8.权利要求1~4任一项所述的醛酮还原酶AKR1D1突变体、权利要求5所述的编码基因、权利要求6所述的载体、权利要求7所述的宿主细胞在制备奥贝胆酸手性中间体-2中的应用。
9.一种制备奥贝胆酸手性中间体-2的方法,其特征在于,包括以下步骤:
...【技术特征摘要】
1.一种醛酮还原酶akr1d1突变体,其特征在于,所述醛酮还原酶akr1d1突变体的氨基酸序列与氨基酸序列如seq id no:2所示的野生型醛酮还原酶akr1d1相比,在seq id no:2所示的氨基酸序列的第132位、第230位、第309位、第311位进行单突变、两两联合突变、三个联合突变或四个联合突变中的任意一种突变。
2.根据权利要求1所述的醛酮还原酶akr1d1突变体,其特征在于,所述单突变为:
3.根据权利要求1所述的醛酮还原酶akr1d1突变体,其特征在于,所述三个联合突变为:
4.根据权利要求1所述的醛酮还原酶akr1d1突变体,其特征在于,所述四个联合突变为:
5.权利要求2~4任一项所述的醛酮还原酶akr1d1...
【专利技术属性】
技术研发人员:余允东,陈伟立,陈佩欣,王树宇,陈振楠,刘德富,
申请(专利权)人:中山百灵生物技术股份有限公司,
类型:发明
国别省市:
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