【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于真菌培养和生物量测定，具体涉及一种基于菌丝和孢子估算am真菌根外总生物量的方法及应用。
技术介绍
1、生物量是反映所有微生物生长状况的一个重要参数。然而，由于大多数微生物(例如，am真菌)与其生长介质易混合的特性，很难直接测定它们的生物量，尤其是在土壤介质中。am真菌与植物根系建立共生关系后会形成根内和根外两部分结构。其中，根外结构是am真菌直接参与获取土壤养分的器官，占am真菌总生物量的90％左右，由根外菌丝和根外孢子(在土壤中)构成。因此，土壤中am真菌菌丝和孢子是评估其根外总生物量的主要参数。然而，由于缺乏对田间am真菌根外菌丝和根外孢子的有效收集和测定，基于称重的am真菌根外总生物量的测量很少进行。
2、目前，评估土壤中am真菌根外生物量常用的方法主要有菌丝或孢子密度法、dna拷贝数法，细胞膜或细胞壁特异性成分法等。然而，这些方法更多的是对am真菌根外生物量的定性描述或半定量分析。例如，菌丝或孢子密度法是一种定性描述am真菌根外生物量的方法，因为该方法仅能得到单位质量土壤中的菌丝长度或孢子个数，而不是基于菌丝和孢子分离称重获得的生物量。同样，dna拷贝数法也仅能得到am真菌在整个生态系统或微生物群落中的相对比例。虽然利用细胞膜或细胞壁特异性成分法在一定程度上能够定量评估am真菌根外生物量，但是由于不同研究者建立的am真菌特异性生物标记物(如磷脂脂肪酸/麦角甾醇)与am真菌根外菌丝干重之间的换算系数相差数十倍。因此，使用该类方法评估am真菌根外生物量会造成较大偏差，且该类方法不仅价格昂贵，而且未将
技术实现思路
1、本专利技术为解决上述技术难题，提供了一种基于菌丝和孢子建模全定量分析田间am真菌根外总生物量的方法。
2、一方面，本申请提供了一种基于菌丝和孢子估算am真菌根外总生物量的方法及应用，包括如下步骤：
3、步骤1：利用蔗糖密度梯度离心法分离土壤中am真菌孢子，并将分离后的孢子通过5个以上不同孔径的土壤筛，然后脱水干燥、称重，拟合孢子生物量与孢子平均直径的数学模型。
4、步骤2：根据玻璃珠培养法收集田间真菌菌体，并确定培养基质中am真菌菌体矫正系数，然后将菌体洗净、除杂和干燥；
5、步骤3：称取5个以上已知质量梯度的菌体样品，经曲利本蓝染色，蔗糖溶液定容和高速搅拌机打碎，待均质后，测定每个质量梯度蔗糖溶液中am真菌孢子个数、孢子平均直径和菌丝长度，然后拟合am真菌菌丝生物量与菌丝长度的数学模型。
6、步骤4：根据步骤1和3所述模型，通过测定田间菌丝长度、孢子个数和孢子平均直径等am真菌特征参数计算其根外总生物量。
7、进一步地，所述步骤1中分离后的孢子过不同孔径土壤筛的过程为：选取孔径为30～300μm的土壤筛，按孔径从大到小依次叠放，最下面的一层用木块垫着，使筛面稍微倾斜，然后将富集孢子的蔗糖溶液倒入筛面，用自来水冲掉蔗糖溶液。
8、进一步地，所述步骤1中按照mg计的所述am真菌孢子生物量sdw与孢子个数n和以μm计的孢子平均直径r的数学模型为sdw＝(5×10-5×r2－6×10-4×r+0.7754)×n×10-3；其中sdw单位为mg，r的单位为μm。
9、进一步地，所述步骤2中田间玻璃珠培养法收集真菌菌体的过程为：以两端粘有30μm尼龙网膜的pvc管作为菌体生长盒，在里面装满过30μm筛的土壤和玻璃珠1:1的混合基质，并调节混合基质中的养分和水分状况与田间土壤条件一致，在作物生长前期埋入株间培养至作物生长后期；待培养结束后，将pvc管内基质倒入30μm湿筛中，用水洗去土，在玻璃珠上收集成团的真菌菌体。
10、进一步地，所述步骤2中培养基质中am真菌菌体矫正系数为am真菌磷脂脂肪酸(16:1ω5c)含量占真菌磷脂脂肪酸(18:1ω9c,18:2ω6c,and 20:1ω9c)含量的比例。
11、进一步地，步骤3所述am真菌菌丝生物量的计算方法为：首先利用菌体质量和am真菌矫正系数获得每个质量梯度蔗糖溶液中am真菌根外总生物量，然后将步骤3所测定的孢子个数和孢子平均直径等参数代入步骤1所述模型确定每个质量梯度蔗糖溶液中am真菌孢子生物量，最后依据两者的差值计算每个质量梯度蔗糖溶液中am真菌菌丝生物量。
12、进一步地，所述步骤3中按照mg计算的所述am真菌菌丝生物量hdw与按照m计的菌丝长度l的数学模型为hdw＝0.0549l－0.5778；其中hdw的单位为mg，l的单位为m。
13、进一步地，所述步骤4中所述am真菌根外总生物量tdw的计算公式为tdw＝(5×10-5×r2－6×10-4×r+0.7754)×n×10-3+0.0549l－0.5778；其中tdw单位为mg，r的单位为μm，l的单位为m，n为孢子个数。
14、另一方面，本申请提供了上述方法在使用am真菌改良和修复土壤的方法中的应用。
15、另一方面，本申请提供了上述方法在使用am真菌辅助种植作物中的应用。
16、另一方面，本申请提供了上述方法在田间am真菌生长情况研究中的应用。
17、使用本专利技术的方法不需要对土壤中am真菌根外结构进行整体收集和称重，仅通过测定土壤中菌丝长度、孢子个数和孢子平均直径等am真菌特征参数便可直接获得其根外总生物量干重，极大地提高了试验测定的精度和速度，为检验菌根技术在田间大规模的生态应用提供了更加简单，便捷的方法。
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1.一种基于菌丝和孢子估算AM真菌根外总生物量的方法及应用，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤1中分离后的孢子过不同孔径土壤筛的过程为：选取孔径为30～300μm的土壤筛，按孔径从大到小依次叠放，最下面的一层用木块垫着，使筛面稍微倾斜，然后将富集孢子的蔗糖溶液倒入筛面，用自来水冲掉蔗糖溶液。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述步骤1中按照mg计的所述AM真菌孢子生物量SDW与孢子个数n和以μm计的孢子平均直径r的数学模型为SDW＝(5×10-5×r2－6×10-4×r+0.7754)×n×10-3；其中SDW单位为mg，r的单位为μm。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤2中田间玻璃珠培养法收集真菌菌体的过程为：以两端粘有30μm尼龙网膜的PVC管作为菌体生长盒，在里面装满过30μm筛的土壤和玻璃珠1:1的混合基质，并调节混合基质中的养分和水分状况与田间土壤条件一致，在作物生长前期埋入株间培养至作物生长后期；待培养结束后，将PVC管内基质倒入30μm湿筛中，用水洗去土，在玻璃珠上收集成团的真菌菌体。
<...【技术特征摘要】
1.一种基于菌丝和孢子估算am真菌根外总生物量的方法及应用，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤1中分离后的孢子过不同孔径土壤筛的过程为：选取孔径为30～300μm的土壤筛，按孔径从大到小依次叠放，最下面的一层用木块垫着，使筛面稍微倾斜，然后将富集孢子的蔗糖溶液倒入筛面，用自来水冲掉蔗糖溶液。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述步骤1中按照mg计的所述am真菌孢子生物量sdw与孢子个数n和以μm计的孢子平均直径r的数学模型为sdw＝(5×10-5×r2－6×10-4×r+0.7754)×n×10-3；其中sdw单位为mg，r的单位为μm。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤2中田间玻璃珠培养法收集真菌菌体的过程为：以两端粘有30μm尼龙网膜的pvc管作为菌体生长盒，在里面装满过30μm筛的土壤和玻璃珠1:1的混合基质，并调节混合基质中的养分和水分状况与田间土壤条件一致，在作物生长前期埋入株间培养至作物生长后期；待培养结束后，将pvc管内基质倒入30μm湿筛中，用水洗去土，在玻璃珠上收集成团的真菌菌体。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述步骤2中培养基质中am真菌菌体矫正系数为am真菌磷脂脂肪酸16:1ω5c含量占真菌磷脂脂...
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