一种用于制备手性醇化合物的羰基还原酶突变体及其用途制造技术

本发明专利技术涉及一种羰基还原酶突变体及其用途，所述羰基还原酶突变体是在对应于SEQ ID NO：2的氨基酸序列存在下述：45位的V突变为I(V45I)，141位的G突变为V(G141V，I195L)，195位的I突变为L(I195L)，204位的A突变为V(A204V)。本发明专利技术羰基还原酶突变体用于手性醇合成时，底物浓度可达100g/L以上，并且有高达99.5％的的立体选择性，酶活性高，催化效率好。本发明专利技术方法与化学合成法相比，显著减少或消除了各类污染性化学品的使用，从而显著降低了环境污染风险。选择了特定的羰基还原酶突变体，酶活性高，立体选择性好，极大地提高生产效率，降低生产成本，适合大规模的工业生产。适合大规模的工业生产。适合大规模的工业生产。

【技术实现步骤摘要】
一种用于制备手性醇化合物的羰基还原酶突变体及其用途


[0001]本专利技术属于酶工程和有机合成领域，尤其涉及一种用于制备手性醇化合物的羰基还原酶突变体及其用途。

技术介绍

[0002]本专利技术是CN202111154268.7的分案申请。
[0003]手性双醇类化合物是靶向肝脏药物所使用的关键中间体，已在多个临床及临床前研究药物中使用。例如甲磺酸帕拉德福韦，该肝靶向前药目前由西安新通医药股份有限公司开发，已完成临床二期，目前正在开展临床三期。该关键双醇中间体均采用化学的合成路线。
[0004]在专利文献US20030225277中报道了制备方法，工艺路线如下：
[0005][0006]该技术方案需要使用有机催化剂(+)
‑
DIPCl，该催化剂价格昂贵，工艺操作繁琐，难以应用于规模化生产。使用该工艺路线制备的双醇化合物的手性纯度为98％，为了满足注册申报要求，需要对其手性纯度进行精制，进一步增加了生产成本，整体路线生产成本较高，因此迫切需要一条满足商业生产的制备方法。
[0007]现有技术中有很多使用羰基还原酶及其突变体对羰基进行还原的文献。羰基还原酶可以实现羰基的高立体选择性，在制备手性醇方面具有广泛的应用。需要解决的问题主要是高的酶活力和立体选择性。
[0008]CN112941043公开了一种羰基还原酶及其突变体，可以用于制备手性β
’
羟基
‑
β
‑
氨基酸；CN112626144A公开了一种用于制备替诺福韦中间体的生物合成方法，使用了羰基还原酶；CN112359028A公开了一种羰基还原酶，是产酶菌株Escherichia coli TM1908接种，发酵得到。
[0009]CN102482648A公开了一种制备α
‑
氯代醇的立体选择性好的酮还原酶。其转化率和立体选择性都高，但是酶活力不足，还不能满足实际需求。特别是工业化大规模制备。
[0010]CN108753851A公开了一种以羰基还原酶为生物催化剂制备手性单羟基衍生化的的手性醇的方法，其利用的羰基还原酶为ChKRED12，其在NCBI数据库中的登录号为KC342012。
[0011]但是利用现有技术中已知的羰基还原酶在还原特定结构的底物时，还存在酶活性
不足的情况，并不利于开展大规模的工业化制备。由于的酶的价格都比较昂贵，酶活性严重制约着是否能产业化。

技术实现思路

[0012]针对现有技术中的羰基还原酶制备手性双醇化合物，特别是帕拉德福韦中间体(S)
‑1‑
(3
‑
卤代苯基)
‑
1,3
‑
丙二醇时，存在酶活性不足的缺陷，本专利技术提出了一种羰基还原酶突变体，其具有更高的酶活性和优异的立体选择性，为(3
‑
卤代苯基)
‑
1,3
‑
丙二醇类的医药中间体的酶合成提供了产业化的便利。
[0013]本专利技术第一个目的是提供一种羰基还原酶突变体，是在对应于SEQ ID NO：2的氨基酸序列存在下述突变之一或者两种以上的组合：45位的V突变为I(V45I)，63位的K突变为Q(K63Q)，141位的G突变为A(G141A)，141位的G突变为V(G141V)，195位的I突变为L(I195L)，204位的A突变为V(A204V)。
[0014]进一步地，所述羰基还原酶突变体，是在对应于SEQ ID NO：2的氨基酸序列存在下述突变之一：
[0015](i)141位的G突变为A(G141A)，且195位的I突变为L(I195L)，其氨基酸序列如SEQ ID No：4所示；
[0016](ii)141位的G突变为V(G141V)，且195位的I突变为L(I195L)，其氨基酸序列如SEQ ID No：6所示。
[0017](iii)45位的V突变为I(V45I)；141位的G突变为V(G141V，I195L)，195位的I突变为L(I195L)，其氨基酸序列如SEQ ID No：8所示；
[0018](iv)45位的V突变为I(V45I)，141位的G突变为V(G141V，I195L)，195位的I突变为L(I195L)，204位的A突变为V(A204V)，其氨基酸序列如SEQ ID No：10所示；
[0019](v)45位的V突变为I(V45I)，63位的K突变为Q(K63Q)，118位的L突变为M(L118M)，141位的G突变为V(G141V，I195L)，204位的A突变为V(A204V)，其氨基酸序列如SEQ ID No：12所示。
[0020]SEQ ID NO：2的氨基酸序列对应的羰基还原酶来源于Novosphingobium aromaticivorans的羰基还原酶NaKRED，参考文献CN102482648，专利技术人通过酶库的筛选，预料不到地发现在对SEQ ID NO：2的氨基酸序列的WO03羰基还原酶的特定位点突变为特定氨基酸后得到的突变体，在利用式(IV)底物制备式(V)时，酶活性高，转化率高，立体选择型好。
[0021]本专利技术提供的羰基还原酶突变体还包括以下范围：对SEQ ID No:4、6、8、10、或12所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，进行一个或多个氨基酸的替换、缺失、改变、插入或增加，所得到的氨基酸序列；或
[0022]对SEQ ID No:4、6、8、10、或12所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，在序列的N端或C端进行一个或多个氨基酸的插入，所述插入的氨基酸残基个数为1
‑
20个；优选1
‑
10个，更优选1
‑
5个。
[0023]对于酶的制备方法，将实现辅酶再生的醇脱氢酶或葡萄糖脱氢酶或甲酸脱氢酶与目的基因构建在同一质粒pET28a(+)载体上，然后导入表达宿主大肠杆菌，通过诱导表达，获得含有目的酶的菌体。可直接使用离心获得菌体，将其破壁获得粗酶液或粗酶粉，用于后
续的生物转化反应。
[0024]本专利技术的第二个目的是提供一种手性双醇类化合物的制备方法，包括以下步骤：
[0025]以式Ⅳ化合物为底物，在辅酶存在下，在上述羰基还原酶催化下，进行不对称还原反应，得到式V化合物；
[0026][0027]其中R基团选自
[0028][0029]中的至少一种；X选自F、Cl、Br、I。
[0030]所述羰基还原酶的加入形式包括菌体、粗酶液、粗酶粉或纯酶。
[0031]优选地，所述反应体系中，所述底物，即式
Ⅵ
化合物的浓度为50～200g/L；更优选为100～150g/L。
[0032]优选地，羰基还原酶的用量与底物质量比率优选为1wt％～6wt％，比如当以湿菌体加入时，加入湿菌体的质量与底物的质量比率为30wt％～100wt％，优选50wt％
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种羰基还原酶突变体，其特征在于，是在对应于SEQ ID NO：2的氨基酸序列存在下述突变：(iv)45位的V突变为I(V45I)，141位的G突变为V(G141V，I195L)，195位的I突变为L(I195L)，204位的A突变为V(A204V)，其氨基酸序列如SEQ ID No：10所示。2.根据权利要求1所述的羰基还原酶突变体，其特征在于，还包括以下范围：对SEQ ID No:10所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，进行一个或多个氨基酸的替换、缺失、改变、插入或增加，所得到的氨基酸序列；或对SEQ ID No:10所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，在序列的N端或C端进行一个或多个氨基酸的插入，所述插入的氨基酸残基个数为1
‑
20个；优选1
‑
10个，更优选1
‑
5个。3.一种手性双醇类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以式Ⅳ化合物为底物，在辅酶存在下，在权利要求1或2所述羰基还原酶催化下，进行不对称还原反应，得到式
Ⅴ
化合物；其中R基团选自其中R基团选自中的至少一种；X选自F、Cl、Br、I。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述羰基还原酶的加入形式包括菌体、粗酶液、粗酶粉或纯酶。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述反应体系中，所述底物，即式
Ⅵ
化合物的浓度为50～200g/L；更优选为100～150g/L；羰基还原酶的用量与底物质量比率优选为1wt％～6wt％。6.根据权利要求3所述的制备方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：倪国伟，尚中栋，郭元勇，袁培斋，高全喜，张数，郜宪兵，高青磊，
申请(专利权)人：山东寰酶生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：