一种合成酶的重组菌株制造技术

本申请属于生物炼制领域，特别涉及一种合成酶的重组菌株，具体的该合成酶具有提高运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的酚醛耐受及乙醇发酵能力的作用，所述重组菌株为I型谷氨酰胺合成酶(ZMO0493)在运动发酵单胞菌中的过量表达，所述重组菌株为Z.mobilis ZM4::pHW20a

【技术实现步骤摘要】
一种合成酶的重组菌株


[0001]本申请属于生物炼制领域，特别涉及一种合成酶的重组菌株，具体的该合成酶具有提高运动发酵单胞菌酚醛耐受及乙醇发酵能力的作用。

技术介绍

[0002]木质纤维素生物质预处理过程是确保纤维素和半纤维素有效水解成单糖的先决条件。但是，各种实用的稀酸、稀碱、离子液体、中性热水、蒸汽膨爆和微波等预处理方法，均不可避免地产生强烈抑制糖化过程纤维素酶的酶活和菌株发酵能力的呋喃醛和酚醛。与呋喃醛不同，酚醛毒性更强，其种类繁多，水溶性较差，生物脱毒效果不理想，因此其对生物质能源和生物基化学品生产的抑制尤其显著。可见，酚醛问题是生物炼制领域的主要瓶颈之一，发酵菌株耐受酚醛是生物质能源和生物基化学品高效发酵的前提。
[0003]glnA(glutamine synthetase)编码的谷氨酰胺合成酶(EC 6.3.1.2)，专司谷氨酸和铵根离子生成氨酰胺的转化过程。就抗逆性而言，谷氨酰胺合成酶可提高生物的氧化胁迫抗性、铵耐受性、镉胁迫和干旱胁迫。然而，谷氨酰胺合成酶对酚醛胁迫耐受的研究鲜见报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术要解决的技术问题是：产乙醇细菌运动发酵单胞菌对酚醛的耐受性较弱，现有的谷氨酰胺合成酶对酚醛胁迫耐受鲜有研究。
[0005]为此，本专利技术提供一种合成酶的重组菌株。
[0006]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0007]一种合成酶的重组菌株，所述重组菌株为I型谷氨酰胺合成酶(ZMO0493)在运动发酵单胞菌中的过量表达，所述重组菌株为Z.mobilis ZM4::pHW20a
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ZMO0493，所述重组菌株具有酚醛耐受和乙醇发酵能力。
[0008]通过采用上述技术方案，由于细菌运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis ZM4)具有较高的乙醇产率、较强的胁迫耐受性和可塑的遗传修饰性等特点，其在生物炼制领域具有突出的应用潜力，运动发酵单胞菌对酚酸具有较好的耐受性，对酚醛的耐受性较弱。但研究也发现运动发酵单胞菌能够将高毒性的酚醛转化为相应的低毒性酚醇，因此选择在运动发酵单胞菌过量表达谷氨酰胺合成酶(ZMO0493)。经过实验证实，ZMO0493过量表达提高了运动发酵单胞菌的菌体生长、葡萄糖消耗、乙醇发酵和酚醛转化能力。
[0009]进一步的，所述重组菌株具有提高运动发酵单胞菌4
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羟基苯甲醛耐受能力的作用。
[0010]进一步的，所述重组菌株具有提高运动发酵单胞菌丁香醛耐受能力的作用。
[0011]进一步的，所述重组菌株具有提高运动发酵单胞菌香草醛耐受能力的作用。
[0012]进一步地，所述重组菌株在添加酚醛后其酚醛转化能力提高，从而使得重组菌株的乙醇发酵能力得以提升。
[0013]进一步的，将筛选的I型谷氨酰胺合成酶(ZMO0493)的重组质粒pHW20a
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ZMO0493转化至宿主菌E.coli S17
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1λπ，再通过接合转化方法将重组质粒pHW20a
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ZMO0493转化至运动发酵单胞菌，得到重组菌株Z.mobilis ZM4::pHW20a
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ZMO0493。
[0014]本专利技术的有益效果是，为生物炼制底盘菌株的木质纤维素来源酚醛耐受性遗传改造提供了新的合成酶重组菌株。该合成酶重组运动发酵单胞菌具有生长快、酚醛耐受能力强和乙醇发酵能力强的能力，且安全无毒。
附图说明
[0015]下面结合附图和实施例对本专利技术进一步说明。
[0016]图1是本专利技术中运动发酵单胞菌合成酶在酚醛胁迫下的基因转录情况示意图。
[0017]图2是本专利技术中对照空载质粒pHW20a和候选目标合成酶基因ZMO0493的重组质粒pHW20a
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ZMO0493的构建图。
[0018]图3是本专利技术中重组质粒鉴定结果图。
[0019]图4是本专利技术中粗酶酶活检测结果图。
[0020]图5是本专利技术中重组运动发酵单胞菌的乙醇发酵能力示意图。
[0021]图6是本专利技术中重组运动发酵单胞菌在4
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羟基苯甲醛胁迫下的乙醇发酵能力示意图。
[0022]图7是本专利技术中重组运动发酵单胞菌在丁香醛胁迫下的乙醇发酵能力示意图。
[0023]图8是本专利技术中重组运动发酵单胞菌在香草醛胁迫下的乙醇发酵能力示意图。
具体实施方式
[0024]现在结合附图对本专利技术作进一步详细的说明。这些附图均为简化的示意图，仅以示意方式说明本专利技术的基本结构，因此其仅显示与本专利技术有关的构成。
[0025]实施例1
[0026]一种合成酶的重组菌株，其为在运动发酵单胞菌Z.mobilis ZM4过量表达I型谷氨酰胺合成酶ZMO0493，该合成酶的重组菌株为Z.mobilis ZM4::pHW20a
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ZMO0493。
[0027]该合成酶菌株的培养与构建方法为，通过转录组测序实验筛选出运动发酵单胞菌在酚醛胁迫下差异表达的合成酶编码基因ZMO0493(Type I glutamine synthetase)。
[0028]对于菌株培养，本专利技术按照1％的接种量将运动发酵单胞菌种子液接种于含20.0g/L的葡萄糖、2.0g/L的KH2PO4和10.0g/L的酵母浸粉的RM(Rich Medium)培养基，在室温30℃的环境下静置培养，每隔4h进行取样。在RM培养基分别添加5mmol/L的4
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羟基苯甲醛、5mmol/L的丁香醛和5mmol/L的香草醛，进行运动发酵单胞菌重组菌株的酚醛耐受实验，以不添加酚醛的实验组作为对照组。
[0029]按照10％的接种量将运动发酵单胞菌种子液接种于含100mL新鲜RM培养基的250mL三角瓶，收集4h细胞供DNA芯片测序。所有的实验设置3个生物学重复。
[0030]本专利技术借助已开展的基于DNA芯片的运动发酵单胞菌耐受酚醛的基因表达谱实验建立合成酶基因表达谱。用Cy3
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dCTP荧光探针标记cDNA片段，用安捷伦GeneSpring version 12软件(Santa Clara，CA，USA)归一化和质控测序数据。参照表1，实验组与对照组荧光信号强度值，经对数转化后即为基因表达谱数据。合成酶差异表达基因定义为酚醛胁
迫下倍数变化≥2.0，显著差异表达基因定义为倍数变化≥2.0和p<0.05。这里，p即P值(P value)，是重复性实验结果的概率统计结果。
[0031]表1酚醛胁迫下的运动发酵单胞菌合成酶基因转录数据处理
[0032][0033]上表中H1为添加4
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羟基苯甲醛的第一个样品的荧光强度值，H2为添加4
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羟基苯甲醛的第二样品的荧光强度值，以此类推；C1为不添加酚醛的第一个对照组样品的荧光强度值，C2为不添加酚醛的第二个对照组样品的荧本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种合成酶的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为I型谷氨酰胺合成酶(ZMO0493)在运动发酵单胞菌中的过量表达，所述重组菌株为Z.mobilis ZM4::pHW20a
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ZMO0493，所述重组菌株具有酚醛耐受和乙醇发酵能力。2.根据权利要求1所述的合成酶的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株具有提高运动发酵单胞菌4
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羟基苯甲醛耐受能力的作用。3.根据权利要求1所述的合成酶的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株具有提高运动发酵单胞菌丁香醛耐受能力的作用。4.根据权利要求1所述的合成酶的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株具有提高运动发酵单胞菌香草醛耐受能力的作用。5.根据权利要求1

【专利技术属性】
技术研发人员：易霞，何玉财，朱劼，
申请(专利权)人：常州大学，
类型：发明
国别省市：