制备甾体药物中间体雄烯二酮和双降醇的基因工程菌、及制备甾体药物中间体雄烯二酮和双降醇的方法技术

本发明专利技术提供制备甾体药物中间体的基因工程菌，该基因工程菌的3

【技术实现步骤摘要】
制备甾体药物中间体雄烯二酮和双降醇的基因工程菌、及制备甾体药物中间体雄烯二酮和双降醇的方法


[0001]本专利技术属于生物技术和生物化工领域，具体涉及分别高产雄烯二酮(AD)和双降醇(BA)的基因工程菌、以及制备雄烯二酮(AD)和双降醇(BA)的方法。

技术介绍

[0002]类固醇药物是仅次于抗生素的第二大类药物，在预防和临床应用的各种疾病如免疫系统疾病、风湿病、肿瘤和炎症方面发挥至关重要的作用。目前，植物甾醇生物转化因其环境友好和反应条件温和而成为生产类固醇中间体最具吸引力的策略之一。该反应路线中，生产菌株为放线菌，其在利用与代谢异型生物质时表现出明显的天然优势，例如分枝杆菌可以利用天然甾醇或一些其他甾体化合物作为唯一的碳和能源。分枝杆菌关于植物甾醇分解代谢途径的中断会导致一些重要中间体的积累，如AD、BA、9
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OHAD、BA等。
[0003]其中，雄烯二酮(AD)和双降醇(BA)是C19和C22甾体化合物中具有代表性的甾体药物中间体。几乎所有用于制备药物的类固醇激素，如肾上腺皮质激素和性激素，都可以由AD或BA合成。具体而言，AD主要用于合成雄激素和蛋白质同化激素；BA主要用于合成孕激素。
[0004]侧链降解和母核完整性是植物甾醇生产AD和BA的基本要求。在植物甾醇生物转化过程中，由于甾醇侧链不能完全降解，C19和C22产物会同时积累。因此，固醇代谢途径可分为C19和C22代谢分支。AD通常是植物甾醇生物转化的主要产物，副产物为BA。17
‑
羟基甾体/22<br/>‑
OH
‑
BNC
‑
CoA脱氢酶(Hsd4A)是位于植物甾醇代谢途径分叉的关键酶，可在侧链降解过程中将22
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羟基
‑
3,24
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二氧基
‑4‑
烯
‑
胆固醇
‑
CoA(22OH
‑
BNC
‑
CoA)转化为3,22,24
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三氧基
‑4‑
烯
‑
胆固醇
‑
CoA(22
‑
oxo
‑
BNC
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CoA)；因此，Hsd4A活性的增加或减少会影响C19和C22产物的转化。具体而言，Hsd4A活性不足导致C22
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甾体药物中间体的积累，而Hsd4A的增强对C19
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甾体药物中间体的产率提高有效。由于Hsd4A的过表达，在M.neoaurum Strain III静息细胞的类固醇生物转化过程中，ADD的产量提高了50％，C22
‑
类固醇副产物减半(doi:10.1128/AEM.02777
‑
17)；M.neoaurum NwIB
‑
XII积累了C19类固醇(AD,1,4
‑
雄甾烯
‑
3,17
‑
二酮(ADD)和睾酮)，而改造后的M.neoaurum NwIB
‑
XIIΔhsd4A积累了C22类固醇HPD和BA作为最终产物(doi:10.1038/srep21928)。另外，研究发现敲除FadA5的突变株可以积累C22中间产物(doi:10.1186/s12934
‑
021
‑
01717
‑
w)。除了Hsd4A调控C19和C22途径的固醇代谢流外，一种双作用还原酶mnOpccr(本研究命名为Opccr)也能将3
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OPC
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CoA和3
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OPA还原为BA(doi:10.1002/anie.202015462)。研究发现，还原酶mnOpccR参与HBC途径的两个分支。mnOpccR在M.neoaurum CCTCC AB2019054中失活和过表达，可分别从植物甾醇中独家生产AD和BA(DOI:10.1002/anie.202015462)。
[0005]KSH是由氧化组分KshA和还原组分KshB组成的双组分加氧酶。KshB将NADH产生的电子转移到KshA的活性中心，然后在氧原子的参与下，由KshA进行C9羟基化。理论上，单独失活KshA或KshB可以阻断C9羟化。虽然在类固醇降解微生物中KshB同工酶的数量比KshA要少，但KshB可能作为多种加氧酶的还原酶参与不同的代谢过程，在KshB缺失突变体中类固
醇降解受到抑制。因此，大多数研究通过灭活KshA来积累C9非羟基化产物。例如，M.neoaurum ATCC 25795
△
kshA1从胆固醇中积累AD和ADD(doi:10.1128/AEM.02777
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17)；M.smegmatis mc2155中kshA1或kshB1的缺失导致β
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谷甾醇、胆固醇或商业植物甾醇积累AD和ADD(doi:10.1111/1751
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7915.12429)。KshA基因的冗余是类固醇代谢微生物如红球菌和分枝杆菌的共同特征，它们之间的KshA同源物发挥着不同的生理作用。第一个KSH酶系统被分类在R.erythropolis SQ1中，其中至少有三个KshA同源物在胆固醇代谢中发挥重要的生理功能。
[0006]目前微生物转化植物甾醇生产AD和BA存在的问题有菌株转化能力低，副产物种类多且存在降解，严重影响生产效益，因此亟需开发高效专一的生产菌株以满足生产需求。

技术实现思路

[0007]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供制备甾体药物中间体的基因工程菌和制备甾体药物中间体雄烯二酮(AD)、双降醇(BA)的方法，用于解决现有技术中的微生物转化植物甾醇生产AD和BA的菌株转化能力低，副产物多的问题。
[0008]为了上述目的和其他目的，本专利技术提供了制备甾体药物中间体的基因工程菌，所述基因工程菌的3
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甾酮
‑
9α
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氢化酶氧化组分KshA的编码基因kshA 1～5基因失活，所述基因工程菌为放线杆菌。
[0009]作为本专利技术的某些实施方式，所述基因工程菌的3
‑
甾酮
‑
9α
‑
氢化酶氧化组分KshA的编码基因kshA 1～5基因被敲除。作为本专利技术的某些实施方式，所述kshA 1～5基因通过CRISPR或同源重组敲除。作为本专利技术的某些实施方式，所述放线杆菌为偶发分枝杆菌Mycobacterium fortuitum MFΔkstD。作为本专利技术的某些实施方式，所述kshA 1～5基因其核苷酸序列分别如SEQ ID No.1～5或其简并序列所示。
[0010]作为本专利技术的某些实施方式，所述基因工程菌的17
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羟基甾体/22
‑
OH
‑
BNC...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.制备甾体药物中间体的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的3
‑
甾酮
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9α
‑
氢化酶氧化组分KshA的编码基因1～5基因失活，所述基因工程菌为放线菌；优选地，所述基因工程菌的3
‑
甾酮
‑
9α
‑
氢化酶氧化组分KshA的编码基因kshA1～5基因被敲除；优选地，所述kshA1～5基因通过CRISPR或同源重组敲除；优选地，所述放线杆菌为偶发分枝杆菌Mycobacterium fortuitum MFΔkstD；优选地，所述kshA1～5基因其核苷酸序列分别如SEQ ID No.1～5或其简并序列所示。2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的17
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羟基甾体/22
‑
OH
‑
BNC
‑
CoA脱氢酶Hsd4A过表达，和/或所述基因工程菌的双功能还原酶Opccr失活；优选地，所述基因工程菌的17
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羟基甾体/22
‑
OH
‑
BNC
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CoA脱氢酶Hsd4A过表达是在所述基因工程菌中增加17
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羟基甾体/22
‑
OH
‑
BNC
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CoA脱氢酶基因的拷贝；优选地，所述基因工程菌的17
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羟基甾体/22
‑
OH
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BNC
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CoA脱氢酶Hsd4A过表达是在所述基因工程菌中增加M.neoaurium ATCC 44074基因组中17
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羟基甾体/22
‑
OH
‑
BNC
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CoA脱氢酶基因的一个拷贝；优选地，所述M.neoaurium ATCC 44074基因组中17
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羟基甾体/22
‑
OH
‑
BNC
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CoA脱氢酶基因其核苷酸序列如SEQ ID No.9或其简并序列所示；优选地，所述基因工程菌的双功能还原酶Opccr基因被敲除；优选地，所述双功能还原酶Opccr基因通过CRISPR或同源重组敲除；优选地，所述双功能还原酶Opccr基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6或其简并序列所示。3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的17
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羟基甾体/22
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OH
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BNC
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CoA脱氢酶Hsd4A基因失活；优选地，所述基因工程菌的17
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羟基甾体/22
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OH
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BNC
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CoA脱氢酶Hsd4A基因被敲除；优选地，所述Hsd4A基因通过CRISPR或同源重组敲除；优选地，所述基因工程菌的17
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羟基甾体/22
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OH
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BNC
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CoA脱氢酶Hsd4A基因其核苷酸序列如SEQ ID NO：7或其简并序列所示。4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的硫酯酶fadA5基因失活；优选地，所述基因工程菌的硫酯酶fadA5基因被敲除；优选地，所述fadA5基因通过CRISPR或同源重组敲除；优选地，所述基因工程菌的硫酯酶fadA5基因其核苷酸序列如SEQ ID NO：8或其简并序列所示。5.一种制备甾体药物中间体雄烯二酮的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求2所述的基因工程菌用于发酵底物植物甾醇；所述发酵生产的条件为发酵温度30℃
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37℃，pH为7
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【专利技术属性】
技术研发人员：张保国，韩苏皖，刘相岑，张静娴，杜桂林，翟星荟，贺蓓茹，史吉平，
申请(专利权)人：中国科学院上海高等研究院，
类型：发明
国别省市：