本发明专利技术涉及一种固定化过氧化物酶的制备方法，包括载体的预处理，用超声波将磁铁颗粒分散到壳聚糖和冰醋酸的溶液中，加入含乳化剂的石蜡油，加入戊二醛溶液，干燥后得到表面包裹壳聚糖的磁铁颗粒、成膜材料的选择，选择聚磺化苯乙烯钠盐和聚盐酸烯丙胺分别作载体的Ａ层膜电解质材料和Ｂ层膜电解质材料、配置过氧化物酶溶液、静电交替沉积，经过Ａ层膜的吸附和Ｂ层膜的吸附等步骤。本发明专利技术用层层自组装技术将过氧化物酶固定化到纳米磁铁颗粒的表面，不仅具有固定酶量多，且酶活力保留量较大；本发明专利技术制得的固定化过氧化物酶活性高，有很高的稳定性，可以回收循环利用，可以用于含苯酚苯胺废水的无害化处理。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于环境科学领域，涉及一种新型环境功能材料，具体地说是一种以纳米磁铁颗粒为载体的。
技术介绍
酶的固定化是指通过物理或化学的方法将酶分子固定到载体表面。固定化酶的制 备方法有物理法和化学法两大类。主要的物理固定方法有吸附法、包埋法。吸附法操作简 单，条件温和，不会引起酶的变性失活，但酶与载体结合部不太牢固而易脱落。包埋法虽然 可以固定大量的酶，但酶在底物反应过程中造成较大的传质阻力。化学固定法是目前应用 最多的酶固定化技术，酶与载体结合牢固，制得的固定化酶稳定性好，但制备过程中反应条 件较为强烈，难以控制，最终可能导致酶被固定化后失活较为严重。层层自组装技术是基于静电相吸而产生多层膜自组装体系的技术，通过轮流地交 换吸附溶液，使两种带相反电荷的离子相互吸引结合构成多层膜结构。具体而言就是将底 物上带有电荷的聚合物表面连续而又交替地沉浸在带有完全相反电荷的两种溶液中，利用 静电相吸的作用，使带不同电荷的两种物质有序而紧凑地连接在一起，重复数次得到多层 膜结构。该技术在材料、生物和药物/基因释放等领域得到了广泛的应用。但迄今为止，层 层自组装技术在环境科学领域的应用还是空白。
技术实现思路
本专利技术针对上述问题，提供一种，该方法利用层层 自组装技术制备固定化过氧化氢酶，制得的固定化过氧化氢酶活性高、稳定性好。按照本专利技术的技术方案一种，包括以下步骤a.载体的预处理用超声波将磁铁颗粒按质量体积比为1 10 1 20的比例 分散到含20g/L壳聚糖和冰醋酸的溶液中，混合均勻，充分搅拌下逐滴加入含乳化剂的 石蜡油，继续搅拌，加入戊二醛溶液作为交联剂，40°C下反应lh，然后加入适量NaOH溶液， 调节PH至9 10，用石油醚或乙醇洗去多余的壳聚糖和石蜡油，干燥后得到表面包裹壳聚 糖的磁铁颗粒；b.成膜材料的选择选择聚磺化苯乙烯钠盐和聚盐酸烯丙胺分别作载体的A层膜 电解质材料和B层膜电解质材料，用IOmmol的醋酸缓冲液配制浓度为2% 5%的聚电解 质溶液，加0. 05% 0. 08% NaCl溶液控制聚电解质溶液的离子强度；c.配置过氧化物酶溶液用pH4. 5 5. 5醋酸缓冲液配制酶活力为250U/mg的过 氧化物酶溶液；d.静电交替沉积A层膜的吸附将载体置于A层膜聚电解质溶液和过氧化物酶溶液的混合溶液中， 通过静电作用，使过氧化物酶沉积吸附在载体表面，吸附20min 60min后，用缓冲液冲洗 2min 20min ；B层膜的吸附将经过A层膜吸附后的载体置于B层膜聚电解质溶液和过氧化物 酶溶液的混合溶液中，通过静电作用，使过氧化物酶沉积吸附在载体表面，吸附20min 60min后，用缓冲液冲洗2min 20min ；e.重复d步骤至少一次，即得固定化过氧化物酶。所述石蜡油含Span-80乳化剂，所述石蜡油含Span-80乳化剂的体积浓度为 0. 5%。所述戊二醛溶液的体积浓度为8%。所述步骤e中，重复d步骤三次。本专利技术的技术效果在于本专利技术用层层自组装技术将过氧化物酶固定化到纳米磁 铁颗粒的表面，不仅具有固定酶量多，且酶活力保留量较大；本专利技术制得的固定化过氧化物 酶活性高，有很高的稳定性，可以回收循环利用，可以用于含苯酚苯胺废水的无害化处理。本专利技术具有两大优势1、可以形成多层酶结构，达到较高酶上载量；2、可在常温 水溶液中进行，不形成共价键，可以保证蛋白质分子维持生物活性的天然构象，从而最大程 度的保留其催化活性。具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明。本专利技术是一种，包括以下步骤a.载体的预处理用超声波将磁铁颗粒按质量体积比为1 10 1 20的比例 分散到含20g/L壳聚糖和冰醋酸的溶液中，混合均勻，充分搅拌下逐滴加入含乳化剂的 石蜡油，继续搅拌，加入戊二醛溶液作为交联剂，40°C下反应lh，然后加入适量NaOH溶液， 调节PH至9 10，用石油醚或乙醇洗去多余的壳聚糖和石蜡油，干燥后得到表面包裹壳聚 糖的磁铁颗粒。所述石蜡油含体积浓度为0.5%的Span-80乳化剂。所述戊二醛溶液的体 积浓度为8%。磁铁颗粒的粒径为50nm，可由Sigma-Aldrich公司购得。预处理的目的是 使载体表面带上电荷，以便聚电解质和酶的组装。b.成膜材料的选择选择聚磺化苯乙烯钠盐(PSS)和聚盐酸烯丙胺(PAH)分别作 载体的A层膜电解质材料和B层膜电解质材料，用IOmmol的醋酸缓冲液配制浓度为2% 5%的聚电解质溶液，加0. 05% 0. 08% NaCl溶液控制聚电解质溶液的离子强度；c.配置过氧化物酶溶液用pH4. 5 5. 5醋酸缓冲液配制酶活力为250U/mg的过 氧化物酶溶液；d.静电交替沉积A层膜的吸附将载体置于A层膜聚电解质溶液和过氧化物酶溶液的混合溶液中，通过静电作用，使过氧化物酶沉积吸附在载体表面，吸附20min 60min后，用缓冲液冲洗 2min 20min ；B层膜的吸附将经过A层膜吸附后的载体置于B层膜聚电解质溶液和过氧化物 酶溶液的混合溶液中，通过静电作用，使过氧化物酶沉积吸附在载体表面，吸附20min 60min后，用缓冲液冲洗2min 20min ；e.重复d步骤至少一次，最好是重复d步骤三次，即得固定化过氧化物酶。本专利技术用层层自组装技术将过氧化物酶固定化到纳米磁铁颗粒的表面，不仅具有固定酶量多，且酶活力保留量较大；本专利技术制得的固定化过氧化物酶活性高，有很高的稳定性，可以回收循环利用，可以用于含苯酚苯胺废水的无害化处理。本专利技术制得的固定化过氧化物酶可通过以下方法测定其酶活性pH 6. 0的过氧 化氢，IOmmol愈创木酚，用分光光度计在470nm处测定最大吸光值，以每分钟吸光度变化值 表示酶活性的大小。固定化酶稳定性(温度、pH、储存)分别取游离酶和固定化酶置于70°C水浴中保 温，定时取样监测其活性，从而确定酶的热稳定性。取适量游离酶和固定化酶，分别置于PH 值不同的缓冲溶液中，25°C保温，每隔一段时间取样测定活性。将游离酶和固定化酶在4°C 保藏1、2、3、4、5、6周后，测定酶活性。以下是本专利技术的具体实施例实施例1a.载体的预处理用超声波将1. Og粒径为50nm的磁铁颗粒分散到20ml含20g/ L壳聚糖和冰醋酸的溶液中，混合均勻，充分搅拌下逐滴加入含体积浓度为0.5%的 Span-80乳化剂的石蜡油，继续搅拌30min，加入体积浓度为8%的戊二醛溶液作为交联剂， 40°C下反应lh，然后加入适量NaOH溶液，调节pH至9 10，用石油醚或乙醇洗去多余的壳 聚糖和石蜡油，干燥后得到表面包裹壳聚糖的磁铁颗粒。b.成膜材料的选择选择聚磺化苯乙烯钠盐(PSS)和聚盐酸烯丙胺(PAH)分别作 载体的A层膜电解质材料和B层膜电解质材料，用IOmmol的醋酸缓冲液配制浓度为2%的 聚电解质溶液，加0. 05% NaCl溶液控制聚电解质溶液的离子强度；c.配置过氧化物酶溶液用pH4. 5醋酸缓冲液配制酶活力为250U/mg的过氧化物 酶溶液；d.静电交替沉积A层膜的吸附将载体置于A层膜聚电解质溶液和过氧化物酶溶液的混合溶液中， 通过静电作用，使过氧化物酶沉积吸附在载体表面，吸附60min后，用缓冲液冲洗20min;B层膜的吸附将经过A层膜吸附后的载本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种固定化过氧化物酶的制备方法，其特征是，包括以下步骤： ａ．载体的预处理：用超声波将磁铁颗粒按质量体积比为１∶１０～１∶２０的比例分散到含２０ｇ／Ｌ壳聚糖和１％冰醋酸的溶液中，混合均匀，充分搅拌下逐滴加入含乳化剂的石蜡油，继续搅拌，加入戊二醛溶液作为交联剂，４０℃下反应１ｈ，然后加入适量ＮａＯＨ溶液，调节ｐＨ至９～１０，用石油醚或乙醇洗去多余的壳聚糖和石蜡油，干燥后得到表面包裹壳聚糖的磁铁颗粒； ｂ．成膜材料的选择：选择聚磺化苯乙烯钠盐和聚盐酸烯丙胺分别作载体的Ａ层膜电解质材料和Ｂ层膜电解质材料，用１０ｍｍｏｌ的醋酸缓冲液配制浓度为２％～５％的聚电解质溶液，加０．０５％～０．０８％ＮａＣｌ溶液控制聚电解质溶液的离子强度； ｃ．配置过氧化物酶溶液：用ｐＨ４．５～５．５醋酸缓冲液配制酶活力为２５０Ｕ／ｍｇ的过氧化物酶溶液； ｄ．静电交替沉积： Ａ层膜的吸附：将载体置于Ａ层膜聚电解质溶液和过氧化物酶溶液的混合溶液中，通过静电作用，使过氧化物酶沉积吸附在载体表面，吸附２０ｍｉｎ～６０ｍｉｎ后，用缓冲液冲洗２ｍｉｎ～２０ｍｉｎ； Ｂ层膜的吸附：将经过Ａ层膜吸附后的载体置于Ｂ层膜聚电解质溶液和过氧化物酶溶液的混合溶液中，通过静电作用，使过氧化物酶沉积吸附在载体表面，吸附２０ｍｉｎ～６０ｍｉｎ后，用缓冲液冲洗２ｍｉｎ～２０ｍｉｎ； ｅ．重复ｄ步骤至少一次，即得固定化过氧化物酶。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陆隽鹤，赵晓联，王欣，宦志荣，
申请(专利权)人：无锡市金坤生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。