一种荧光报告蛋白制造技术

本发明专利技术公开了一种荧光报告蛋白，通过在野生型荧光蛋白内部的特定位置插入能被识别并裂解的外源氨基酸序列，而不影响荧光蛋白的发光功能，从而形成一种全新的荧光报告蛋白，当插入的外源氨基酸序列被识别并裂解后，直接破坏了荧光蛋白的结构，导致荧光淬灭，基于这种现象，可以进行多种应用，比如对蛋白酶活性的评价，对蛋白酶抑制剂效果的评价

【技术实现步骤摘要】
一种荧光报告蛋白


[0001]本专利技术涉及蛋白质工程
，特别涉及一种荧光报告蛋白
。

技术介绍

[0002]绿色荧光蛋白
(Green fluorescent protein
，简称
GFP)
，是一个由约
238
个氨基酸组成的蛋白质，从蓝光到紫外线都能使其激发，发出绿色荧光
。
虽然许多其他海洋生物也有类似的绿色荧光蛋白，但传统上，绿色荧光蛋白（
GFP
）指首先从维多利亚多管发光水母中分离的蛋白质
。
这种蛋白质最早是由下村脩等人在
1962
年在维多利亚多管发光水母中发现
。
这个发光的过程中还需要冷光蛋白质水母素的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子可产生交互作用
。
[0003]在维多利亚多管发光水母中发现的野生型绿色荧光蛋白，
395nm
和
475nm
分别是最大和次大的激发波长，它的发射波长的峰点是在
509nm
，在可见光谱中处于绿光偏蓝的位置
。
野生型绿色荧光蛋白，最开始是 约
238 个氨基酸的肽链，约 25KDa。
然后按一定规则，
11 条
β
‑
折叠在外周围成圆柱状的栅栏；圆柱中，
α
‑
螺旋把发色团固定在几乎正中心处
。
发色图被围在中心，能避免偶极化的水分子
、
>顺磁化的氧分子或者顺反异构作用与发色团，致使荧光猝灭
。
[0004]在细胞生物学与分子生物学中，绿色荧光蛋白
(GFP)
基因常用做报告基因
(reporter gene)。
绿色荧光蛋白基因也可以克隆到脊椎动物
(
例如
:
兔子
)
上进行表现，并拿来映证某种假设的实验方法
。
通过基因工程技术，绿色荧光蛋白
(GFP)
基因能转进不同物种的基因组，在后代中持续表达
。
现在，绿色荧光蛋白
(GFP)
基因已被导入并表达在许多物种，包括细菌，酵母和其他真菌，鱼（例如斑马鱼），植物，苍蝇，甚至人等哺乳动物的细胞
。
[0005]此外，绿色荧光蛋白可以通过定点突变发出不同波长的光，如
BFP
为蓝色
(
当
Tyr
‑
66
被
His
取代时
)
，
CFP
为青色
(
当
Tyr
‑
66
被
Trp
取代时
)
，
YFP
为黄色
(
当
Thr203
被
Tyr
取代时
)。
绿色荧光蛋白及其红色
、
蓝色
、
黄色和橙色的近亲已经彻底改变了生物医学研究，使每一种主要疾病从因果关系的角度在实验室里“点亮”，供研究人员可视化
、
理解并最终征服它们
。
[0006]基于
GFP
的诸多优点，譬如广谱性
、
稳定性
、
易于载体构建与检测
、
无毒害，
GFP
在细胞筛选
、
基因表达
、
细胞标记
、
遗传跟踪等领域被广泛应用
。GFP
作为一种活体报告蛋白同时它的荧光强度很高，易于活体观测和用仪器进行定量检测
。GFP
的三级结构对于荧光的产生是十分重要的，蛋白质变性及分离的发色团都无法产生荧光
。
通常情况下，为了不破坏
GFP
的三级结构，均是在其
N
端和
C
端进行多种蛋白质的融合
。
类似这样的改造荧光蛋白，虽然不影响
GFP
的发光，但是，外加的蛋白本身的断裂也不会影响
GFP
发光
。
[0007]在病毒复制增殖过程中，均需要有蛋白酶的帮助
。
例如：人类免疫缺陷病毒（
HIV
，
Human immunodeficiency virus
）蛋白酶能够将
HIV
的
gag
基因和
gag
‑
pol
基因表达的多聚蛋白裂解成病毒需要的蛋白
。HIV
蛋白酶在
HIV
病毒的成熟与复制过程中起到非常关键的作用，抑制该酶会产生无感染力的子代病毒，从而阻止病毒进一步感染；又如，新冠病毒的多聚蛋白由两种病毒蛋白酶进行裂解，木瓜蛋白酶样蛋白酶（
PLpro
，
papain
‑
like protease
）
和
3C
样蛋白（
3CLpro
，3‑
chymotrypsin like protease
），它们分别负责3个位点和
11
个位点的蛋白裂解
。3CLpro
是冠状病毒复制所必须的酶，
3CLpro
由于它的切割特异性很强，可避免脱靶的可能，可作为有效的抗病毒药物靶点
。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于提供一种经改造的荧光报告蛋白，通过在野生型荧光蛋白内部的特定位置插入能被识别并裂解的外源氨基酸序列，而不影响荧光蛋白的发光功能，从而形成一种全新的荧光报告蛋白，当插入的外源氨基酸序列被识别并裂解后，直接破坏了荧光蛋白的结构，导致荧光淬灭，基于这种现象，可以进行多种应用，比如对蛋白酶活性的评价，对蛋白酶抑制剂效果的评价
、
抗病毒药物的筛选等
。
[0009]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种荧光报告蛋白，通过改造荧光蛋白而成，具体为：在野生型荧光蛋白的特定位置插入能被蛋白酶识别并裂解的外源氨基酸序列，插入的外源氨基酸序列不影响荧光蛋白的发光功能；所述特定位置包括插入区域
、
插入区域外单独的插入位点；插入区域为第一插入区域
、
第二插入区域或第三插入区域，第一插入区域为绿色荧光蛋白
GFP
氨基酸序列的第
116
‑
120
位氨基酸，或与绿色荧光蛋白
GFP
氨基酸序列相比具有
95%
以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；第二插入区域为绿色荧光蛋白
GFP
氨基酸序列的第
154
‑
160
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种荧光报告蛋白，其特征在于：通过改造野生型荧光蛋白而成，具体为：在野生型荧光蛋白的特定位置插入能被蛋白酶识别并裂解的外源氨基酸序列，插入的外源氨基酸序列不影响荧光蛋白的发光功能；所述特定位置包括插入区域
、
插入区域外单独的插入位点；插入区域为第一插入区域
、
第二插入区域或第三插入区域，第一插入区域为绿色荧光蛋白
GFP
氨基酸序列的第
116
‑
120
位氨基酸，或与绿色荧光蛋白
GFP
氨基酸序列相比具有
95%
以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；第二插入区域为绿色荧光蛋白
GFP
氨基酸序列的第
154
‑
160
位氨基酸，或与绿色荧光蛋白
GFP
氨基酸序列相比具有
95%
以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；第三插入区域为绿色荧光蛋白
GFP
氨基酸序列的第
170
‑
177
位氨基酸，或与绿色荧光蛋白
GFP
氨基酸序列相比具有
95%
以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；插入区域外单独的插入位点包括独立位点
A、
独立位点
B
，独立位点
A
为绿色荧光蛋白
GFP
氨基酸序列的第
10
‑
11
位氨基酸，或与绿色荧光蛋白
GFP
氨基酸序列相比具有
95%
以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；独立位点
B
为绿色荧光蛋白
GFP
氨基酸序列的第
139
‑
140
位氨基酸，或与绿色荧光蛋白
GFP
氨基酸序列相比具有
95%
以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；所述绿色荧光蛋白
GFP
氨基酸序列见
SEQ ID No.1
所示
。2.
根据权利要求1所述的荧光报...

【专利技术属性】
技术研发人员：方晨捷，孙慧敏，陈瑞婷，武小琰，简书令，宋家升，
申请(专利权)人：浙江迪福润丝生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：