一种基于制造技术

本发明专利技术公开了一种基于

【技术实现步骤摘要】
一种基于BRET的甲基对硫磷生物传感器、构建方法及其应用


[0001]本专利技术属于水体农药残留检测领域，特别涉及一种基于
BRET
的甲基对硫磷生物传感器
、
构建方法及其应用
。

技术介绍

[0002]随着现代农业的发展，大量的甲基对硫磷
(MP)
类有机磷农药排放到水环境，给生态环境和人类健康带来了巨大威胁，亟需建立针对水体
MP
浓度的简便
、
快速且高灵敏度的方法，提高环境监测的效率，进而更有效的防范有机磷农药的危害
。
然而现有的
MP
检测方法存在诸多不足之处：基于仪器的分析方法操作复杂
、
耗时长
、
且需要昂贵的设备和训练有素的专业人员；基于酶的传感器方法受到各种化学物质的抑制，缺乏稳定性，并且持续需要底物源来量化农药水平
。
因此，有必要研发一种操作简便
、
快速
、
环境友好的检测
MP
的新方法
。
[0003]近年来，基于生物发光
‑
共振
‑
能量转移
(BRET)
的生物传感器由于其灵敏度高
、
能避免光漂白和自体荧光等优点已被广泛应用于医学
、
食品等领域
。BRET
生物传感器由与配体特异性结合的敏感
(
识别
)
元件
、
生物发光供体及荧光受体组成
。
由于生物传感器与配体结合后会发生构象变化，影响生物传感器的光学性质，通过建立光学性质与配体浓度的相关关系即可实现配体化合物的识别与检测
。
[0004]猝灭体
(Q
‑
body)
是一种基于抗体的免疫传感器，常通过用荧光染料标记
scFv
的
N
末端区域或抗体的抗原结合片段来构建
。
当具有短柔性接头肽的抗体
N
端标记的荧光染料进入抗体的可变区域时，由于染料的疏水性，可变区域中的色氨酸残基可通过从色氨酸到染料的光诱导电子转移引起的荧光猝灭来削弱染料的荧光
。
当
Q
‑
body
与抗原结合时，由于抗原依赖性
Fv
稳定和结合抗原引起的空间位阻，猝灭的染料不能再停留在抗体内部并移动到外部，并恢复其荧光
。
荧光恢复的量随着结合抗原浓度的增大而增加，这是
Q
‑
body
传感器定量测定的基础
。
该技术易于操作，只需将样品添加到探针溶液中，即可在几秒钟到几分钟内测量荧光强度，具有简便
、
快速
、
灵敏度高等优点
。
[0005]纳米荧光素酶
(Nluc)
是一种来自深海虾的工程化萤光素酶，是一种体积小
(19kDa)、
亮度高但稳定的蛋白质，与其他萤光素酶相比，它产生增强和持续的发光
。
因此，
Nluc
可用于作为构建
BRET
生物传感器检测的的生物发光供体
。

技术实现思路

[0006]本专利技术通过对
MP
生物传感器进行设计，旨在提供一种基于
BRET
的
MP
生物传感器
、
构建方法以及应用，通过以对甲基对硫磷特异性响应的单链可变区片段抗体
(MP scFv)
作为敏感元件，以纳米荧光素酶
(Nluc)
为生物发光供体，以
R6G
马来亚酰胺荧光染料为荧光受体，构建了一种用于水体中甲基对硫磷检测的生物传感器，利用纳米荧光素酶
(Nluc)
能够催化底物呋喃嗪产生
450nm
的生物发光，并通过共振能量转移激发
R6G
马来亚酰胺荧光染料产生
560nm
的发射光，当生物传感器结合甲基对硫磷后会发生基于
Q
‑
body
原理的
R6G
马来亚酰胺荧光染料的荧光恢复，以及
R6G
马来亚酰胺荧光染料与纳米荧光素酶
Nluc
之间距离减
LysY、Origami2(DE3)
或
ArcticExpress(DE3)
；所述卡那霉素抗性
LB
固体培养基的质量体积浓度为
100
μ
g/mL
，所述卡那霉素抗性
LB
液体培养基的质量体积浓度为
50
μ
g/mL
；所述诱导表达条件为：
0.1
～
1mM IPTG
，温度为
16
～
30℃
，转速为
100
～
200rpm
；所述在卡那霉素抗性
LB
液体培养基中培养条件：温度为
[0018]30
～
37℃
，转速为
100
～
200rpm。
[0019]优选的，步骤
S3
中，所述裂解条件为：裂解温度为0～
4℃
，功率为
100
～
150W
，裂解时间为
15
～
30min
；所述尿素梯度透析条件为：每隔
12h
依次替换一次含1～
2mM
氧化和还原型谷胱甘肽的
4M
尿素缓冲液
、
两次
2M
尿素缓冲液和两次不含尿素的缓冲液
。
[0020]优选地，步骤
S4
中，所述
Nluc
‑
MP scFv
蛋白与
R6G
马来亚酰胺荧光染料的摩尔比为1：
20
～1：
10
；所述
Nluc
‑
MP scFv
蛋白和
R6G
马来亚酰胺荧光染料共同孵育时的温度为0～
4℃
，孵育时间为
12
～
16h。
[0021]本专利技术的目的之三在于提供上述基于
BRET
的甲基对硫磷生物传感器在水体中甲基对硫磷检测中的应用
。
[0022]优选的，将上述基于
BRET
的甲基对硫磷生物传感应用于水体中甲基对硫磷检测的方法，包括如下步骤：
[0023]A1、
采集水样：对待测水体进行取样，得到水体样本，过滤，得到待测水样试样；
[本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种基于
BRET
的甲基对硫磷生物传感器，其特征在于，所述生物传感器为由对甲基对硫磷特异性响应的单链可变区片段抗体
MP scFv、
半胱氨酸标签
Cys
‑
tag
和纳米荧光素酶
Nluc
融合表达得到的融合蛋白，其氨基酸序列如
SEQ ID NO.2
所示；其中，所述单链可变区片段抗体
MP scFv
与半胱氨酸标签
Cys
‑
tag
及纳米荧光素酶
Nluc
通过柔性肽接头连接，所述单链可变区片段抗体
MP scFv
来源于预免疫小鼠噬菌体展示文库，其氨基酸序列如
SEQ ID NO.1
所示；所述半胱氨酸标签
Cys
‑
tag
偶联
R6G
马来亚酰胺荧光染料
。2.
根据权利要求1所述的甲基对硫磷生物传感器，其特征在于，所述柔性肽接头的氨基酸序列为5×
GGGGS
；所述纳米荧光素酶
Nluc
的氨基酸序列如
SEQ ID NO.3
所示
。3.
一种如权利要求1或2所述的基于
BRET
的甲基对硫磷生物传感器的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、
质粒的合成：采用
DNA
合成仪分别合成半胱氨酸标签
Cys
‑
tag
基因
、
单链可变区片段抗体
MP scFv
基因
、P17
‑
tag
基因
、FLAG
‑
tag
基因及
His
‑
tag
基因，利用重叠延伸
‑
聚合酶链式反应拼接技术，分别设计连接引物，扩增并按顺序依次组装，得到全长基因；将组装后得到的全长基因插入
pET
‑
24b(+)
载体的
BamHⅠ和
HindⅢ位点之间，构建成
pET
‑
MP scFv
；在
pET
‑
MP scFv
的半胱氨酸标签
Cys
‑
tag
基因和单链可变区片段抗体
MP scFv
基因之间插入5×
GGGGS
柔性接头基因，得到质粒，命名为
pET
‑
MP scFv
‑
S5
；采用
GenSmart
在线工具对
Nluc
基因进行密码子优化，然后将合成优化后的基因插入至
pET
‑
MP scFv
‑
S5
的
Cys
‑
tag
基因的
N
端，获得重组质粒
pET
‑
Nluc
‑
MP scFv
；
S2、
转化与表达：将步骤
S1
构建的重组质粒
pET
‑
Nluc
‑
MP scFv
在感受态大肠杆菌菌株中转化，并涂布在卡那霉素抗性
LB
平板中培养，待其长出菌落，每个菌落即为一个单克隆，挑选培养得到的单克隆菌株接种至卡那霉素抗性
LB
液体培养基中，培养至
OD600
＝
0.6
～
1.0
，经异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代半乳糖苷
(IPTG)
诱导表达后，离心，收集细菌；
S3、
裂解与纯化：将收集的细菌重悬至
TBS
缓冲液中，向其中添加添加蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟
(PMSF)
和溶菌酶，超声裂解，离心收集沉淀，并用
8M
尿素变性缓冲液变性溶解，离心收集上清液，然后采用尿素梯度透析的方法对包涵体表达的蛋白进行复性；利用
Ni
‑
NTA
层析柱进行纯化，得到
Nluc
‑
MP scFv
蛋白；
S4、
荧光染料标记：将
Nluc
‑
MP scFv
蛋白和
R6G
马来亚酰胺荧光染料共同孵育标记，然后利用
Ni
‑
NTA
层析柱和即用型
Sephadex
重力脱盐柱去除过量的荧光染料；纯化并脱盐后得到生物传感器蛋白，即甲基对硫磷生物传感器
。4.
根据权利要求3所述的甲基对硫磷生物传感器的构建方法，其特征在于，步骤
S2
中，所述感受态大肠杆菌菌株为
BL21(DE3)、Shuffle T7 Express LysY、Origami2(DE3)
或
ArcticExpress(DE3)
；所述卡那霉素抗性
LB
固体培养基的质量体积浓度为
100
μ
g/mL...

【专利技术属性】
技术研发人员：张宴，余杰，任洪强，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：