分枝杆菌属纳米载体蛋白的纯化方法技术

本发明专利技术提供了一种分枝杆菌属纳米载体蛋白的纯化方法，属于蛋白纯化技术领域

【技术实现步骤摘要】
分枝杆菌属纳米载体蛋白的纯化方法


[0001]本专利技术属于蛋白纯化
，具体涉及一种分枝杆菌属纳米载体蛋白的纯化方法
。

技术介绍

[0002]纳米隔室
(Encapsulin)
是近年来新发现的一种可以自组装成正二十面体结构的纳米载体蛋白，其直径范围为
25
～
42nm
，并且其内部包裹一个或者多个货物蛋白
(Cargo proteins)
，这赋予了纳米隔室多种生理功能，例如抵抗氧化压力
。
因此，体外纯化获得这些纳米载体蛋白对于进一步改造和应用纳米载体蛋白具有重要的意义
。
[0003]结核分枝杆菌纳米载体蛋白最早在培养基的上清中被发现，因其组成亚基的大小为
29kDa
，故被命名为培养滤液蛋白
(Culture filtrateprotein
，
CFP)CFP29
，并且
CFP29
序列在不同分枝杆菌中较为保守，表明分枝杆菌属纳米载体蛋白具有相似的结构，即正二十面体结构
。
结核分枝杆菌是引起结核病的病原菌，体外纯化结核分枝杆菌及其它分枝杆菌属纳米载体蛋白对于研究其结构功能以及应用具有重要的意义
。
[0004]本领域常用的体外纯化结核分枝杆菌及其它分枝杆菌属纳米载体蛋白的方法一般是内源提取，但是存在产量和纯度较低的问题，难以满足研究需求
。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种分枝杆菌属纳米载体蛋白的纯化方法，本专利技术提供的纯化方法能获得高纯度分枝杆菌属纳米载体蛋白，且生产成本低
。
[0006]本专利技术提供了一种分枝杆菌属纳米载体蛋白的纯化方法，包括以下步骤：
[0007]提供大肠杆菌总蛋白溶液，所述大肠杆菌总蛋白溶液中含有分枝杆菌属纳米载体蛋白，所述分枝杆菌属纳米载体蛋白的亚基
C
端融合有1×
Flag
标签；
[0008]将所述大肠杆菌总蛋白溶液进行
Flag
标签亲和柱层析纯化，得到分枝杆菌属纳米载体蛋白粗提液；
[0009]将所述分枝杆菌属纳米载体蛋白粗提液进行凝胶排阻柱层析纯化，得到分枝杆菌属纳米载体蛋白纯品
。
[0010]优选地，所述分枝杆菌属纳米载体蛋白包括结核分枝杆菌纳米载体蛋白
、
耻垢分枝杆菌纳米载体蛋白
、
牛分枝杆菌纳米载体蛋白
、
脓肿分枝杆菌纳米载体蛋白
、
堪萨斯分枝杆菌纳米载体蛋白和鸟分枝杆菌纳米载体蛋白中的一种或多种
。
[0011]优选地，所述
Flag
标签亲和柱层析纯化所用的色谱柱为填装
Anti
‑
Flag
填料的色谱柱；所述凝胶排阻层析纯化所用的色谱柱为
Superose 6increase10/300
凝胶排阻色谱柱
。
[0012]优选地，所述
Flag
标签亲和柱层析纯化包括依次进行的第一洗脱与第二洗脱；所述第一洗脱所用第一洗脱剂包括4‑
羟乙基哌嗪乙磺酸
、NaCl
和去污剂，所述第二洗脱所用第二洗脱剂包括4‑
羟乙基哌嗪乙磺酸
、NaCl
和1×
Flagpeptide。
[0013]优选地，所述第一洗脱剂中，4‑
羟乙基哌嗪乙磺酸的摩尔浓度为
25
～
50mmol/L
，
NaCl
的摩尔浓度为
150
～
300mmol/L
，去污剂的质量百分含量为
0.01
～
0.02
％
。
[0014]优选地，所述第二洗脱剂中，4‑
羟乙基哌嗪乙磺酸的摩尔浓度为
25
～
50mmol/L
，
NaCl
的摩尔浓度为
150
～
300mmol/L
，1×
Flagpeptide
的质量浓度为
200
～
300
μ
g/mL。
[0015]优选地，所述去污剂为吐温
20。
[0016]优选地，所述凝胶排阻柱层析所用第三洗脱剂包括4‑
羟乙基哌嗪乙磺酸和
NaCl。
[0017]优选地，所述第三洗脱剂中，4‑
羟乙基哌嗪乙磺酸的摩尔浓度为
25
～
50mmol/L
，所述
NaCl
的摩尔浓度为
150
～
300mmol/L。
[0018]优选地，所述大肠杆菌总蛋白溶液的制备方法包括以下步骤：
[0019]将分枝杆菌属纳米载体蛋白融合基因克隆至
pETDuet
‑1质粒上，得到重组质粒；
[0020]将所述重组质粒转入大肠杆菌进行原核表达，得到大肠杆菌工程菌；
[0021]采用重悬试剂对所述大肠杆菌工程菌进行重悬，固液分离后收集上清液，得到大肠杆菌总蛋白溶液
。
[0022]本专利技术提供了一种分枝杆菌属纳米载体蛋白的纯化方法，包括以下步骤：提供大肠杆菌总蛋白溶液，所述大肠杆菌总蛋白溶液中含有分枝杆菌属纳米载体蛋白，所述分枝杆菌属纳米载体蛋白的亚基
C
端融合有1×
Flag
标签；将所述大肠杆菌总蛋白溶液进行
Flag
标签亲和柱层析纯化，得到分枝杆菌属纳米载体蛋白粗提液；将所述分枝杆菌属纳米载体蛋白粗提液进行凝胶排阻柱层析纯化，得到分枝杆菌属纳米载体蛋白纯品
。
本专利技术提供的纯化方法利用分枝杆菌属纳米载体蛋白亚基
C
端的1×
Flag
标签，采用
Flag
标签进行亲和层析纯化，通过
Anti
‑
Flag
填料对1×
Flag
标签的特异性识别，能有效得到富含有分枝杆菌属纳米载体蛋白的粗提液，然后通过凝胶排阻层析获得纯化的分枝杆菌属纳米载体蛋白
。
本专利技术提供的纯化方法操作流程简易，成本较低，获得的分枝杆菌属纳米载体蛋白纯度较高且产量较大，可用于后续分枝杆菌属纳米载体蛋白的结构功能及药物递送研究
。
附图说明
[0023]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图
。
[0024]图1为实施例1中凝胶排阻层析纯化结果图，图1中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种分枝杆菌属纳米载体蛋白的纯化方法，包括以下步骤：提供大肠杆菌总蛋白溶液，所述大肠杆菌总蛋白溶液中含有分枝杆菌属纳米载体蛋白，所述分枝杆菌属纳米载体蛋白的亚基
C
端融合有1×
Flag
标签；将所述大肠杆菌总蛋白溶液进行
Flag
标签亲和柱层析纯化，得到分枝杆菌属纳米载体蛋白粗提液；将所述分枝杆菌属纳米载体蛋白粗提液进行凝胶排阻柱层析纯化，得到分枝杆菌属纳米载体蛋白纯品
。2.
根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述分枝杆菌属纳米载体蛋白包括结核分枝杆菌纳米载体蛋白
、
耻垢分枝杆菌纳米载体蛋白
、
牛分枝杆菌纳米载体蛋白
、
脓肿分枝杆菌纳米载体蛋白
、
堪萨斯分枝杆菌纳米载体蛋白和鸟分枝杆菌纳米载体蛋白中的一种或多种
。3.
根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述
Flag
标签亲和柱层析纯化所用的色谱柱为填装
Anti
‑
Flag
填料的色谱柱；所述凝胶排阻层析纯化所用的色谱柱为
Superose 6increase10/300
凝胶排阻色谱柱
。4.
根据权利要求1或3所述的纯化方法，其特征在于，所述
Flag
标签亲和柱层析纯化包括依次进行的第一洗脱与第二洗脱；所述第一洗脱所用第一洗脱剂包括4‑
羟乙基哌嗪乙磺酸
、NaCl
和去污剂，所述第二洗脱所用第二洗脱剂包括4‑
羟乙基哌嗪乙磺酸
、NaCl
和1×
Flagpeptide。5.
根据权利要求4所述的纯化方法，其特征在于，所述第一洗脱剂中，4‑
羟乙基哌嗪乙磺酸的摩尔浓度为
...

【专利技术属性】
技术研发人员：贡红日，杜占强，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：