JEV制造技术

本发明专利技术公开了一种

【技术实现步骤摘要】
JEV蛋白酶抑制剂的筛选方法和抑制效果评价方法


[0001]本专利技术涉及生物医药
，特别涉及一种
JEV
蛋白酶抑制剂的筛选方法和抑制效果评价方法
。

技术介绍

[0002] 流行性乙型脑炎（
Japanese encephalitis
）简称乙脑，是由流行性乙型脑炎病毒（
Japanese encephalitis virus
，
JEV
）引起的人畜共患自然疫源性疾病
。
其发病和病死率高，约
30%
的患者治愈后会留有不同程度的后遗症
。JEV
属于黄病毒科黄病毒属，是一种单股正链
RNA
病毒，基因全长为
11 kb
，可分为
I、II、III、IV
和
V
型5种基因型
。JEV
基因组有一个开放阅读框，编码一条多聚蛋白，此多聚蛋白被切割成3个结构蛋白：衣壳蛋白
(C)
，前体膜
(prM)、
包膜蛋白
(E)
和7个非结构蛋白：
NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5。
其中
NS3
的
C
端具有
NTP
酶活性和解旋酶活性，
N
端与
NS2B
结合为异源二聚体具有丝氨酸蛋白酶活性，切割多聚蛋白内的
NS2A/NS2B、NS2B/NS3、NS3/NS4A
和
NS4B/NS5
的连接处
。
[0003] NS2B/NS3
蛋白酶在病毒的复制和组装中起到至关重要的作用，缺失该蛋白酶基因会使感染性的病毒粒子无法繁殖，故
JEV
的
NS2B/NS3
蛋白酶是抗病毒药物开发的强有力的药物靶点
。
目前临床上并无治疗乙型脑炎的特效抗病毒药物
。
治疗主要是对症的支持治疗和使用广谱的抗病毒药物
。
因此相应抗病毒药物的开发以及抗病毒药物的筛选评价显得尤为重要
。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种
JEV
蛋白酶抑制剂的筛选方法和抑制效果评价方法，无需使用活病毒，安全性好，能够高效
、
准确
、
稳定
、
高通量的进行
JEV
蛋白酶抑制剂的筛选和抑制效果评价
。
[0005]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种
JEV
蛋白酶抑制剂的筛选方法，包括以下步骤：（1）构建共表达改造的
GFP
和
JEV NS2B/NS3
蛋白酶的质粒，所述改造的
GFP
为在野生型
GFP
上插入
JEV NS2B/NS3
蛋白酶切割序列而成；（2）筛选：将待转染细胞铺于多孔板中，然后加入共表达改造的
GFP
和
JEV NS2B/NS3
蛋白酶的质粒进行转染，对转染后的细胞进行培养，同时向多孔板中添加不同组的待筛选抑制剂，以不添加待筛选抑制剂的为对照，观察细胞状态及荧光拍照，并检测荧光强度；若与对照相比荧光强度增加，则表示待筛选抑制剂具有抑制效果，荧光强度增加越多则代表待筛选抑制剂的抑制效果越强
。
[0006] 本专利技术在绿色荧光蛋白（
GFP
）中插入
JEV
的
NS2B/NS3
蛋白酶相关裂解位点的序列，形成改造后的荧光蛋白报告蛋白系统，在该荧光蛋白报告蛋白质粒上，克隆表达
JEV NS2B/NS3
蛋白酶，可用于筛选蛋白酶抑制剂以及对蛋白酶抑制剂活性的评价，最终形成
JEV
蛋白酶抑制剂筛选及药效评价平台
。
本专利技术能够避免使用
JEV
活病毒引发的安全性顾虑，对
生物安全等级要求低，
BSL
‑1级实验室即可满足实验要求，是高效
、
准确
、
稳定
、
高通量
、
可重复的用于
JEV
蛋白酶抑制剂筛选及药效评价平台
。
[0007] JEV NS2B/NS3
蛋白酶切割序列在野生型
GFP
氨基酸序列上的插入位点包括位点
C
和位点
D
；位点
C
为野生型
GFP
氨基酸序列第
159~160
位氨基酸，或与野生型
GFP
氨基酸序列相比具有
99%
以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；位点
D
为野生型
GFP
氨基酸序列第
170~171
位氨基酸，或与野生型
GFP
氨基酸序列相比具有
99%
以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；所述野生型
GFP
氨基酸序列见
SEQ ID No.1
所示
。
[0008]本专利技术中，位点
C
为野生型
GFP
氨基酸序列第
159~160
位氨基酸，或与野生型
GFP
氨基酸序列相比具有
99%
以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；对应的氨基酸区域指的是与野生型
GFP
氨基酸序列相比具有
99%
以上序列一致性的氨基酸序列上与野生型
GFP
氨基酸序列的第
159~160
位氨基酸相对应的位置
。
其它类似表述的地方参考本处释义
。
[0009] 专利技术人研究发现，在上述两个特定位点（位点
C、
位点
D
）插入
JEV NS2B/NS3
蛋白酶切割序列后，改造的
GFP
荧光蛋白仍然可以检测到激发荧光
。
[0010] JEV NS2B/NS3
蛋白酶切割序列包括
cut1、cut2
，
cut1
氨基酸序列为
AGKRSAIS
，
cut2
氨基酸序列为
SLKRGRPG。JEV NS2B/NS3
蛋白酶切割序列能准确地被
JEV NS2B/NS3
蛋白酶识别和切割，切割后则会破坏荧光蛋白发光功能，导致荧光淬灭
。
[0011] 位点
C
上插入的
JEV NS2B/NS3
蛋白酶切割序列为
c本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种
JEV
蛋白酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）构建共表达改造的
GFP
和
JEV NS2B/NS3
蛋白酶的质粒，所述改造的
GFP
为在野生型
GFP
上插入
JEV NS2B/NS3
蛋白酶切割序列而成；（2）筛选：将待转染细胞铺于多孔板中，然后加入共表达改造的
GFP
和
JEV NS2B/NS3
蛋白酶的质粒进行转染，对转染后的细胞进行培养，同时向多孔板中添加不同组的待筛选抑制剂，以不添加待筛选抑制剂的为对照，观察细胞状态及荧光拍照，并检测荧光强度；若与对照相比荧光强度增加，则表示待筛选抑制剂具有抑制效果，荧光强度增加越多则代表待筛选抑制剂的抑制效果越强
。2. 根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，
JEV NS2B/NS3
蛋白酶切割序列在野生型
GFP
氨基酸序列上的插入位点包括位点
C
和位点
D
；位点
C
为野生型
GFP
氨基酸序列第
159~160
位氨基酸，或与野生型
GFP
氨基酸序列相比具有
99%
以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；位点
D
为野生型
GFP
氨基酸序列第
170~171
位氨基酸，或与野生型
GFP
氨基酸序列相比具有
99%
以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；所述野生型
GFP
氨基酸序列见
SEQ ID No.1
所示
。3. 根据权利要求1或2所述的筛选方法，其特征在于，
JEV NS2B/NS3
蛋白酶切割序列包括
cut1、cut2
，
cut1
氨基酸序列为
AGKRSAIS
，
cut2
氨基酸序列为
SLKRGRPG。4. 根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，位点
C
上插入的
JEV NS2B/NS3
蛋白酶切割序列为
cut1
或
cut2
；位点
D
上插入的
JEV NS2B/NS3
蛋白酶切割序列为 cut2。5. 一种共表达改造的
...

【专利技术属性】
技术研发人员：简书令，周孟云，方晨捷，陈瑞婷，宋家升，
申请(专利权)人：浙江迪福润丝生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：