一种融合蛋白制造技术

本发明专利技术提供一种融合蛋白

【技术实现步骤摘要】
一种融合蛋白、质粒及其在HIV蛋白酶抑制剂筛选及药效评价中的应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种融合蛋白
、
质粒及其在
HIV
蛋白酶抑制剂筛选及药效评价中的应用
。

技术介绍

[0002] 获得性免疫缺陷综合征
(Acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)
又称艾滋病，是由人类免疫缺陷病毒
(Human immunodeficiency virus, HIV)
引起的全球性重大疾病
。
联合国在
2018
年的艾滋病报告中指出，过去的二十年间，
HIV
已经导致了
7000
万人感染，大约
3500
万人死亡
。2018
年新发感染
HIV
的人数有
170
万人，全球每年死于
AIDS
相关性疾病的患者仍高达数十万人
。HIV
有1型和2型两种亚型，其中1型是目前全球流行的主要毒株
。
[0003] HIV
的基因组由两条相同的正链
RNA
组成，全长约
9.7 kb。
其基因组包裹在一个病毒蛋白壳内，核衣壳外周是来源于宿主细胞膜的磷酸脂质双层和病毒编码的膜蛋白
。HIV
基因组含有3个结构基因
gag、pol
和
env/>，其中
gag
基因序列编码核壳蛋白；
env
基因序列编码病毒感染细胞所必须的两种糖蛋白，即包膜糖蛋白
gp120
和
gp41
；
pol
基因序列编码病毒复制所必须的酶，即逆转录酶
、
结合酶和病毒蛋白酶
。HIV
蛋白酶是一种天冬氨酸蛋白酶，仅以同型二聚体的形式活跃
。
它能够将
HIV
的
gag
基因和
gag
‑
pol
基因表达的多聚蛋白裂解成病毒需要的蛋白
。Gag
区携带病毒结构蛋白，而
Pol
区含有病毒酶
(
蛋白酶
、
逆转录酶
、RNase H
和整合酶
)。
[0004] HIV
蛋白酶在
HIV
病毒的成熟与复制过程中起到非常关键的作用，抑制该酶会产生无感染力的子代病毒，从而阻止病毒进一步感染
。1995
年，第一个具有全新作用机制的抗病毒化合物
——
沙奎那韦获得
FDA
批准，它是一种
HIV
蛋白酶的拟肽抑制剂
。
随后出现了针对病毒感染不同步骤的其他病毒蛋白酶抑制剂和化合物
。
更多的蛋白酶抑制剂药物可以为治疗方案的搭配提供更多的选择
。
因此，开发针对病毒蛋白酶抑制剂的药效评价系统十分重要
。
[0005]大多数高传染性病毒的细胞抗病毒实验需要在
BSL
‑
2+
或者更高等级的实验室进行，然而这种实验室的资源相当短缺
。
目前所应用的体外大规模筛选及药效评价方法按检测原理主要分为两类：（1）竞争结合法：是主要的体外筛选方法，将现有蛋白酶固相化后加入待筛选药物与现有有效的药物竞争性结合固相化蛋白酶
。
其中待筛药物可带有检测标记如同位素
、
生物素
、
荧光物质等，进行检测
。
它是与现有蛋白酶抑制剂竞争结合位点，因此仅能筛选出已知蛋白酶抑制剂的同类物
。
对于针对序列不同的不能结合己知蛋白酶抑制剂的蛋白酶及耐药性蛋白酶的药物筛选及评价效果不好
。
（2）功能测定法：利用含蛋白酶酶切位点短肽的荧光淬灭分子来作为蛋白酶的底物，使用蛋白酶切割该底物后荧光基因与淬灭基团分离发出荧光，因此通过检测荧光强度即可判断所筛药物的活性，但此方法易受小分子化合物干扰出现假阳性问题
。
同时，许多体外活性良好的抑制剂因为其细胞膜通透性不好，在细胞内没有活性或活性很弱
。
[0006]因此，开发一种简洁
、
安全
、
高通量和可重复性的蛋白酶活性以及相关蛋白酶抑制剂筛选及药效评价平台十分必要
。

技术实现思路

[0007]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种融合蛋白
、
质粒及其在
HIV
蛋白酶抑制剂筛选及药效评价中的应用
。
[0008]为了解决上述问题，本专利技术提出以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包括
HIV
荧光报告蛋白及
HIV
蛋白酶
PR
，所述
HIV
荧光报告蛋白及
HIV
蛋白酶
PR
由自剪切
2A
短肽连接；所述
HIV
荧光报告蛋白是在野生型
GFP
荧光蛋白序列的特定位点中插入
HIV
蛋白酶
PR
的酶切序列得到的重组
GFP
基因，再将所述重组
GFP
基因插入真核表达载体后表达产生
。
[0009]进一步地，所述
HIV
荧光报告蛋白具有与野生型
GFP
荧光蛋白相同或相近的激发荧光活性
。
[0010] 可以理解地，本专利技术所述的
HIV
荧光报告蛋白是由野生型
GFP
（
Green fluorescent protein
，绿色荧光蛋白）改造得到，改造后的蛋白不影响
GFP
荧光蛋白原有的荧光活性
。
[0011] 进一步地，所述蛋白酶
PR
的酶切序列插入于野生型
GFP
荧光蛋白的位置包括
site15、site20
以及
site24
；其中，
site15
位于如
SEQ ID NO.4
（
MADKQKN
）所示的氨基酸序列的
KQ
和
KN
之间；
site20
位于如
SEQ ID NO.5
（
FEGDTL
）所示的氨基酸序列的
EG
和
DT
之间；
site24
位于如
SEQ ID NO.6(DKQKNGI )
所示的氨基酸序列的<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种融合蛋白，其特征在于，包括
HIV
荧光报告蛋白及
HIV
蛋白酶
PR
，所述
HIV
荧光报告蛋白及
HIV
蛋白酶
PR
由自剪切
2A
短肽连接；所述
HIV
荧光报告蛋白是在野生型
GFP
荧光蛋白序列的特定位点中插入
HIV
蛋白酶
PR
的酶切序列得到的重组
GFP
基因，再将所述重组
GFP
基因插入真核表达载体后表达产生
。2.
如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述
HIV
荧光报告蛋白具有与野生型
GFP
荧光蛋白相同或相近的激发荧光活性
。3.
如权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述蛋白酶
PR
的酶切序列插入于野生型
GFP
荧光蛋白的位置包括
site15、site20
以及
site24
；其中，
site15
位于如
SEQ ID NO.4
所示的氨基酸序列的
KQ
和
KN
之间；
site20
位于如
SEQ ID NO.5
所示的氨基酸序列的
EG
和
DT
之间；
site24
位于如
SEQ ID NO.6
所示的氨基酸序列的
QK
和
NG
之间
。4.
如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述
HIV
蛋白酶
PR
的酶切氨基酸序列为
RVLAEA
...

【专利技术属性】
技术研发人员：简书令，方晨捷，倪思睿，孙慧敏，宋家升，
申请(专利权)人：浙江迪福润丝生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：