使用检测微球测定样品中目标分子浓度的方法技术

本发明专利技术提供使用检测微球测定样品中目标分子浓度的方法

【技术实现步骤摘要】
使用检测微球测定样品中目标分子浓度的方法、计算机可读介质和分析设备


[0001]本专利技术涉及测定生物样品中目标分子的浓度的方法，特别是极低浓度的目标分子的浓度的方法
。
本专利技术还涉及存储有执行该方法的指令的计算机可读介质以及相应的分析设备
。

技术介绍

[0002]能够测量来自生物样品的低丰度分析物对于包括临床诊断在内的数个领域都是非常重要的
。
许多蛋白和核酸诊断生物标记物以极低的浓度存在，这要求其分析方法具有非常低的检测极限
。
[0003]然而，对于浓度在皮摩尔（
pM
）
、
飞摩尔（
fM
）
、
阿摩尔（
aM
）甚至介摩尔（
zM
）的目标分子而言，精确的浓度测定非常具有挑战性
。
已知的一种解决方案利用抗体标记微球，每个样品添加数千至数百万个微球来捕获样品中的目标分子，并以酶报告分子来标记目标分子
。
该方案将微球分散到空间上相互隔离的小孔中，并基于泊松分布来计算单个微球上的酶平均数量，该方案假设在低浓度下绝大多数微球上并不偶联酶分子（“off”球），所以利用偶联有酶分子的微球（“on”球）占所有微球的比例表征单个微球上的酶平均数量，这种算法也被称为数字算法
。
但在高浓度下，大多数微球上结合有多于1个酶分子，数字算法不再适用，因此转而通过计算包含偶联有酶分子的微球的小孔的平均荧光强度与单酶荧光强度的比值来表征单个微球上的酶平均数量，这种算法也被称为模拟算法
。
在实际应用中，将
70%
的“on”球作为阈值，低于
70%
时使用数字算法，高于
70%
时使用模拟算法
。
[0004]然而，数字算法和模拟算法在
70%
或其他阈值时的平滑衔接依赖于分子在微球上的完美的泊松分布
。
泊松分布假定所有分子和微球都是相同的，分子在微球上随机结合，没有偏差，结合亲和力在浓度变化时仍保持不变，并且检测出来的强度均一
。
然而，这在现实情况中是无法实现的，实际情况中有各种因素会导致微球和分子的结合不是随机分布或检测信号不均一，包括但不限于，酶和底物浓度的均一性
、
小孔体积的均一性
、
各仪器之间的差别
、
激发光的不均匀性
、
成像质量的不均匀性等等
。
实际上，最近的报道已经证实了模拟算法和数字算法之间的不连续性
。
[0005]有鉴于此，有必要克服现有技术中的缺陷提供一种新的浓度测定方法，使其在所有浓度范围上具有测定连续性
。

技术实现思路

[0006]本专利技术的一个方面提供一种使用检测微球测定样品中目标分子的浓度的方法，包括以下步骤：（
a
）提供微孔，其中在一部分微孔中包含底物和检测微球，而在另一部分微孔中包含底物但不包含检测微球，至少一个所述检测微球的表面包含由第一配体
‑
目标分子
‑
报告分子形成的三明治结构，所述报告分子包含能够催化底物发出第一荧光的催化剂；（
b
）密封微孔以使每个微孔之间流体隔离；（
c
）获得至少一部分检测微球的微球图片，并对选定
区域内包含微球的微孔进行计数，以获得微孔总数；（
d
）按预定时间间隔，获取对应第一荧光的
N
张第一荧光图片，
N
是大于等于2的整数；（
e
）对齐至少两张第一荧光图片与微球图片，获取所述选定区域内每个包含微球的微孔在所述至少两张第一荧光图片的每张中的微孔亮度值，并对每张第一荧光图片的所述微孔亮度值求和，获得每张第一荧光图片的微孔亮度总和；（
f
）获取所述至少两张第一荧光图片的微孔亮度总和之间的至少一个差值或多个差值的平均值；（
g
）以所述至少一个差值或所述多个差值的平均值，除以所述微孔总数，得到亮度值平均增长量，作为特征值；（
h
）获得特征值对浓度的标准曲线；和（
i
）根据所述标准曲线以及目标分子的特征值测定所述样品中的目标分子的浓度
。
[0007]在一些实施方式中，在步骤（
f
）中：当
N
为偶数时，将第
N
张第一荧光图片的微孔亮度值总和减去第
N/2
张第一荧光图片的微孔亮度值总和获得第一差值，将第
N
‑1张第一荧光图片的微孔亮度值总和减去第
(N/2
‑
1)
张第一荧光图片的微孔亮度值总和获得第二差值，依次类推，直至获得第
N/2+1
张第一荧光图片的微孔亮度值总和与第1张第一荧光图片的微孔亮度值总和的第
N/2
差值
。
[0008]在一些实施方式中，在步骤（
f
）中：当
N
为奇数时，将第
N
张第一荧光图片的微孔亮度值总和减去第
(N+1)/2
张第一荧光图片的微孔亮度值总和获得第一差值，将第
N
‑1张第一荧光图片的微孔亮度值总和减去第
(N+1)/2
‑1张第一荧光图片的微孔亮度值总和获得第二差值，依次类推，直至获得第
(N+1)/2+1
张第一荧光图片的微孔亮度值总和与第2张第一荧光图片微孔亮度值总和的第
(N
‑
1)/2
差值
。
[0009]在一些实施方式中，在步骤（
f
）中：当
N
为奇数时，将第
N
‑1张第一荧光图片的微孔亮度值总和减去第
(N
‑
1)/2
张第一荧光图片的微孔亮度值总和获得第一差值，将第
N
‑2张第一荧光图片的微孔亮度值总和减去第
(N
‑
1)/2
‑1张第一荧光图片的微孔亮度值总和获得第二差值，依次类推，直至获得第
(N
‑
1)/2+1
张第一荧光图片的微孔亮度值总和与第1张第一荧光图片微孔亮度值总和的第
(N
‑
1)/2
差值
。
[0010]在一些实施方式中，其中步骤（
a
）包括对底物进行加热
。
例如，在一些实施方式中，将底物加热至
30~40
°
C
，并维持
30
分钟时间
。
[0011]在一些实施方式中，在步骤（
c
）和
/
或（
d
）中，使用...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种使用检测微球测定样品中目标分子的浓度的方法，包括以下步骤：（
a
）提供微孔，其中在一部分微孔中包含底物和检测微球，而在另一部分微孔中包含底物但不包含检测微球，至少一个所述检测微球的表面包含由第一配体
‑
目标分子
‑
报告分子形成的三明治结构，所述报告分子包含能够催化底物发出第一荧光的催化剂；（
b
）密封微孔以使每个微孔之间流体隔离；（
c
）获得至少一部分检测微球的微球图片，并对选定区域内包含微球的微孔进行计数，以获得微孔总数；（
d
）按预定时间间隔，获取对应第一荧光的
N
张第一荧光图片，
N
是大于等于2的整数；（
e
）对齐至少两张第一荧光图片与微球图片，获取所述选定区域内每个包含微球的微孔在所述至少两张第一荧光图片的每张中的微孔亮度值，并对每张第一荧光图片的所述微孔亮度值求和，获得每张第一荧光图片的微孔亮度总和；（
f
）获取所述至少两张第一荧光图片的微孔亮度总和之间的至少一个差值或多个差值的平均值；（
g
）以所述至少一个差值或所述多个差值的平均值，除以所述微孔总数，得到亮度值平均增长量，作为特征值；（
h
）获得特征值对浓度的标准曲线；和（
i
）根据所述标准曲线以及目标分子的特征值测定所述样品中的目标分子的浓度
。2.
根据权利要求1所述的方法，其中在步骤（
f
）中：（1）当
N
为偶数时，将第
N
张第一荧光图片的微孔亮度值总和减去第
N/2
张第一荧光图片的微孔亮度值总和获得第一差值，将第
N
‑1张第一荧光图片的微孔亮度值总和减去第
(N/2
‑
1)
张第一荧光图片的微孔亮度值总和获得第二差值，依次类推，直至获得第
N/2+1
张第一荧光图片的微孔亮度值总和与第1张第一荧光图片的微孔亮度值总和的第
N/2
差值；（2）当
N
为奇数时，将第
N
张第一荧光图片的微孔亮度值总和减去第
(N+1)/2
张第一荧光图片的微孔亮度值总和获得第一差值，将第
N
‑1张第一荧光图片的微孔亮度值总和减去第
(N+1)/2
‑1张第一荧光图片的微孔亮度值总和获得第二差值，依次类推，直至获得第
(N+1)/2+1
张第一荧光图片的微孔亮度值总和与第2张第一荧光图片微孔亮度值总和的第
(N
‑
1)/2
差值；或（3）当
N
为奇数时，将第
N
‑1张第一荧光图片的微孔亮度值总和减去第
(N
‑
1)/2
张第一荧光图片的微孔亮度值总和获得第一差值，将第
N
‑2张第一荧光图片的微孔亮度值总和减去第
(N
‑
1)/2
‑1张第一荧光图片的微孔亮度值总和获得第二差值，依次类推，直至获得第
(N
‑
1)/2+1
张第一荧光图片的微孔亮度值总和与第1张第一荧光图片微孔亮度值总和的第
(N
‑
1)/2
差值
。3.
根据权利要求1所述的方法，其中步骤（
a
）包括对底物进行加热
。4.
根据权利要求3所述的方法，其中将底物加热至
30~40
°
C
，并维持
30
分钟时间
。5.
根据权利要求1所述的方法，其中在步骤（
c
）和
/
或（
d
）中，使用
LED
光源照射微孔，以获得相应的图片
。6.
根据权利要求5所述的方法，其中
LED
光源的功率为
0.1W~10W。7.
根据权利要求1所述的方法，其中步骤（
a
）中所述提供微孔包括提供位于微流体装置的通道中的微孔
。
8.
根据权利要求1所述的方法，其中步骤（
b
）中所述密封包括使用油进行密封
。9.
根据权利要求1所述的方法，其中步骤（
d
）进一步包括对第一荧光图片进行预处理以排除异常光斑
。10.
根据权利要求9所述的方法，其中所述预处理包括基于深度学习的目标检测
。11.
根据权利要求1所述的方法，其中在步骤（
c
）中，所述检测微球包含荧光染料，激发所述荧光染料以使检测微球发出第二荧光从而获得所述微球图片，所述第二荧光不同于所述第一荧光
。12.
根据权利要求1所述的方法，其中在步骤（
c
）中，所述选定区域是微球图片的全部区域
。13.
根据权利要求1所述的方法，其中在步骤（
e
）中，每个微孔的微孔亮度值是以9×9个像素显示的单个微孔的亮度值总和或是以9×9个像素显示的单个微孔的亮度均值
。14.
根据权利要求1所述的方法，其中在步骤（
e
）之前，对第一荧光图片采用校正算法
。15.
根据权利要求
14
所述的方法，其中所述校正算法包括：（
i
）对于图片的中央区域，获取每个微孔9×9像素的光强分布矩阵
Ii
，其中
i
为整数并且对应于微孔编号，将
Ii
除以该矩阵最大元素值，获得归一化光强分布矩阵
IIi
，将区域内所有微孔的归一化光强分布矩阵
IIi
的所有元素取平均，获取
Ia
，以此作为每个微孔光强分布的校正矩阵；并且（
ii
）对于图片的边缘区域，获取每个微孔9×9像素的光强分布矩阵
IIIj
，
j
为整数并且对应于微孔编号，获取每个9×9像素区域内的强度最大值，使用
Ia
校正矩阵乘以该强度最大值，作为每个微孔的准确光强分布，以此对所述边缘区域进行校正，获取新的图片作为第一荧光图片
。16.
根据权利要求1所述的方法，其中在
30~37℃
之间的任一恒温条件下进行步骤（
a
）
。17.
根据权利要求1所述的方法，其中在步骤（
a
）中，所述报告分子由与目标分子特异性结合的第二配体和所述催化剂组成，所述第二配体不同于所述第一配体，并且步骤（
a
）包括：（
i
）提供可能包含目标分子的样品；（
ii
）加入检测微球，所述检测微球的表面修饰有与目标分子特异性结合的所述第一配体；（
iii
）加入报告分子；（
iv
）加入底物；（
v
）将检测微球导入微孔中；其中步骤执行顺序为：
i/ii/iii
‑
iv
‑
v
或
i/ii/iii/v
‑
iv
，其中“/”表示其前后步骤可互换，
“‑”
表示其前后步骤按所示顺序执行
。18.
根据权利要求1所述的方法，其中在步骤（
a
）中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：请求不公布姓名，
申请(专利权)人：博瑞生物医药苏州股份有限公司，
类型：发明
国别省市：