一种禽流感灭活疫苗及其制造方法技术

本发明专利技术涉及一种禽流感灭活疫苗及其制造方法，本发明专利技术所涉及的疫苗含有经灭活的Ｈ９亚型禽流感病毒液和常规油佐剂；本发明专利技术是用Ｈ９亚型ＨＮ３０７株禽流感病毒（ＣＧＭＣＣＮｏ．３５９８）分别接种鸡胚培养，收获感染胚液，经甲醛溶液灭活，加常规油佐剂乳化制成。用本发明专利技术方法制备的疫苗接种鸡能安全有效的预防Ｈ９亚型禽流感。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，属于动物用生物制品技术的领 域。
技术介绍
禽流感(Bird Flu或Avian Influenza)是由禽流感病毒引起的一种急性传染 病，也能感染人类，人感染后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的 肺炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡，病死率很高，通常人感染禽流感死亡率约为 33%。此病可通过消化道、呼吸道、皮肤损伤和眼结膜等多种途径传播，区域间的人员和车 辆往来是传播本病的重要途径。禽流感是禽流行性感冒的简称，它是一种由甲型流感病毒的一种亚型(也称禽流 感病毒)引起的传染性疾病，被国际兽疫局定为甲类传染病，又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟。按 病原体类型的不同，禽流感可分为高致病性、低致病性和非致病性禽流感三大类。非致病性 禽流感不会引起明显症状，仅使染病的禽鸟体内产生病毒抗体。低致病性禽流感可使禽类 出现轻度呼吸道症状，食量减少，产蛋量下降，出现零星死亡。高致病性禽流感最为严重，发 病率和死亡率均高，人感染高致病性禽流感死亡率约是60%，家禽鸡感染的死亡率几乎是 100%，无一幸免。禽流感是世界范围分布的，1994年、1997年、1999年和2003年分别在澳大利亚、意大利、中国香港、荷兰等地爆发，2005年则主要在东南亚和欧洲爆发。除鸡群中的禽流感 主要发生在冬、春季节外，没有其他明显的规律性。高致病性禽流感疫情的蔓延引起世界关注。禽流感病毒(Avian Influenza virus,AIV)属甲型流感病毒。流感病毒属于RNA 病毒的正黏病毒科，分甲、乙、丙3个型。其中甲型流感病毒多发于禽类，一些亚型也可感 染猪、马、海豹和鲸等各种哺乳动物及人类。甲型流感病毒呈多形性，其中球形直径80 120nm，有囊膜。基因组为分节段单股负链RNA。依据其外膜血凝素(HA)/和神经氨酸酶 (NA)蛋白抗原性的不同，目前可分为15个H亚型(Hl H15)和9个N亚型(附 N9)。有研究表明，原本为低致病性禽流感病毒株(H5N2、H7N7、H9N2)，可经6 9个月 禽间流行的迅速变异而成为高致病性毒株(H5m)。这种现象的出现正是由于甲型流感病毒 所具有的HA和NA 二者的遗传性或抗原性漂移及遗传性或抗原性转移导致的抗原性变异所 致(陆承平主编.兽医微生物学第四版.中国农业出版社，1980.)。1997年在香港发现H9N2禽流感病毒也可以由禽直接传染给人。1992年在我国华 南地区已发现H9亚型，1994年分离的代表株为A/chicken/Beijingl/94(H9N2)，直到1998 年前后，才在河北及京津地区的鸡群造成广泛流行。研究表明，流行的病毒是从1994年的 分离株进化而来，具有气溶胶传播的新特点，因此传播率大大提高(陆承平主编.兽医微生 物学第四版.中国农业出版社，1980.)。
技术实现思路
本专利技术的目的是利用本专利技术人分离的一株H9亚型禽流感病毒制备出灭活疫苗用 于鸡预防H9亚型禽流感。本专利技术所涉及的禽流感灭活疫苗系用本专利技术人由我国分离到并经过系统鉴定的 一株H9亚型禽流感病毒接种鸡胚培养，收获感染胚液，用甲醛溶液灭活、混合，加常规油佐 剂乳化制成。本专利技术的详细描述1病毒株来源H9亚型HN307株禽流感病毒是本专利技术人由我国一个发病鸡场的发病鸡群采集的 病料中分离到，经本专利技术人实验室检验和鉴定，后经国家禽流感研究中心进行了鉴定，确诊 为禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)H9亚型，命名为HN307株，本病毒已于2010 年02月02日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏号 CGMCC No. 3598。2病毒株特性(1)血凝抑制试验按“中国兽药典”HI试验方法，配制4单位HN307株病毒液， 然后用四种阳性血清进行交叉试验。该病毒凝集红细胞的特性能被禽流感H9阳性血清特 异性中和，不能被ND、EDS及H5阳性血清中和。HN307株病毒第1代HA价为71og2，传至第 2代HAHA彡81og2上升为81og2 (AIV H9及H5阳性血清购自哈尔滨兽医研究所)。(2)回归试验将HN307株病毒E2代用灭菌生理盐水10倍稀释后，静脉接种5只 6周龄SPF鸡(SPF鸡胚由北京梅里亚维通试验动物技术有限公司提供，SPF鸡由本厂采用 SPF鸡胚孵化获得)，接种剂量为0. 2ml/羽，接种后第5天，分别取喉头及泄殖腔棉拭子分 离病毒。将分离毒接种SPF鸡后第14天，5只鸡中有1只有轻微呼吸道症状，未见死亡。5 只鸡的喉头及泄殖腔棉拭子，尿囊液HA检验均有血凝性，且能被H9阳性血清中和。(3)毒种传代将AIV HN307株E2代毒种用灭菌生理盐水做10000倍稀释，尿囊 腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚0. 1ml，置37°C继续孵育，24小时前死亡的鸡胚弃去不计， 在24 96小时死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚液，装于灭菌容器内，注明收获日期、毒种代 次等，此代毒为E3代毒。按上述方法，将HN307株毒可在鸡胚上复制传代。(4)纯净性1)无菌检验将E3 E10代毒种分别按“中国兽药典”规定的方法进行，利用硫 乙醇酸盐培养基(T. G)、酪胨琼脂斜面(G. A)和葡萄糖蛋白胨汤(G. P)进行无菌检验(中国 兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇〇五年版三部.中国农业出版社，2005，本发 明中简称“中国兽药典”)。2)支原体检验将AIV HN307 E3 E10代毒种分别接种改良Frey氏培养基，按 “中国兽药典”规定方法进行检验。3)外源病毒检验采用鸡检验法。3周龄SPF雏鸡30只，分成2组，每组15只， 分别滴鼻接种1 10稀释的毒种，肌肉注射1 10稀释的毒种，免疫21日后，用上述方 法重复免疫一次，设相同条件SPF鸡对照5只。第一次免疫42日后采血，进行有关疫病的 血清抗体检验，检验项目有传染性法氏囊病(IBD)、禽腺病毒I型(Adeno)、产蛋下降综合征 (EDS)、禽脑脊髓炎(AE)、禽流感(AI)H9和H5亚型、禽呼肠孤(RE0)、鸡痘(FP)、传染性喉气管炎(ILT)、鸡传染性支气管炎(IB)、禽白血病(AL)、鸡马立克氏病(MD)、鸡新城疫(ND)、网 状内皮增生病(RE)。结果表明，AIV HN307 E3至E10代毒种无细菌、支原体、外源病毒污染。结果见表 1，表明本专利技术所涉及的病毒是纯净的。(5)红细胞凝集试验按“中国兽药典”规定方法进行检验，HA效价为8 10 log2。结果见表1.(6)病毒含量测定将AIV HN307毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10_6、 10_7、10_8、10_94个稀释度，各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5个，每胚0. 1ml，置37°C继续 孵育，24小时前死亡的鸡胚弃去不计，在24 96小时死亡的鸡胚随时取出，置2 8°C保 存，至96小时，取出所有鸡胚，逐个收获鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价> 61og2者 判为感染，按Reed-Muench法计算EID5(i。结果为病毒含量为107 83 108_32。(见表1)试验结果见表1。表1 AIV HN307株E3 E10代病毒纯净、HA效价及病毒含量检测结果 (7)免疫原性将AIV 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种禽流感灭活疫苗灭活疫苗，其特征在于本品含有经灭活的Ｈ９亚型ＨＮ３０７株禽流感病毒，本病毒已于２０１０年０２月０２日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏号ＣＧＭＣＣＮｏ．３５９８，病毒液和常规油佐剂。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：岳建新，李吉轩，梅忠，丰素兰，杨培豫，何海蓉，周建民，彭平，刘莉，
申请(专利权)人：乾元浩生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]