一种突变型Taq酶及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种突变型Taq酶及其制备方法，所述突变型Taq酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术通过氨基酸突变位点Q592K、S612R、A643L、V649L、A689I、F697I、和V720I，得到突变型Taq酶，在相同条件下的检测中突变型Taq酶的活性较市售Taq酶的活性有明显的提高,同时在热稳定性方面，突变型Taq酶较市售Taq酶有明显改善。有明显改善。有明显改善。

【技术实现步骤摘要】
一种突变型Taq酶及其制备方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体地涉及一种突变型Taq酶及其制备方法。

技术介绍

[0002]1969年，美国印第安那大学的微生物学家Thomas Brock和他的研究生Hudson Freeze从黄石国家森林公园火山温泉中发现了一种嗜热型海栖热袍菌T.aquaticus(Taq)。1976年Trela和他的华裔研究生钱嘉韵Alice Chien分离纯化得到了Taq DNA聚合酶。后来测得它的分子量65kD，全长2496个碱基,编码832个氨基酸。1986年6月，Mullis的同事Saiki首次将纯化的Taq酶应用在PCR中，从此，开始了PCR质的飞跃，Taq DNA聚合酶大放异彩是在PCR反应中的应用。
[0003]随着PCR应用越来越多样化，实验要求的提升和生物样本复杂性的提高，“野生型”Taq酶的缺点也逐渐凸显出来，如扩增效率低、特异性差、高AT或GC含量样本扩增结果差、样本中或PCR系统中的有些抑制剂对反应有干扰等等，导致酶活性低、耐热性差的问题，远远不能满足人们的需求。因此需要对现有Taq进行进一步的改造来改善Taq DNA聚合酶的酶活性和耐热性等。科研人员利用大肠杆菌可以任意突变，改造，然后通过扩增、酶切、连接、表达、提纯等步骤进行一次又一次的改造和筛选来生产要求更高的Taq酶来适应更为广泛的工业生产以及科研应用。

技术实现思路

[0004]专利技术目的：
[0005]鉴于现有技术的上述缺点、不足，本专利技术提供一种突变型Taq酶及其制备方法。
[0006]技术方案：
[0007]本专利技术的第一方面，提供了一种突变型Taq酶，所述突变型Taq酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0008]本专利技术的第二方面，提供了一种核酸，所述核酸编码本专利技术的第一方面所述的突变型Taq酶，所述的核酸具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
[0009]本专利技术的第三方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有第二方面所述的核酸。
[0010]进一步的，所述的宿主细胞选自大肠杆菌DH5α感受态细胞。
[0011]本专利技术的第四方面，提供了如第一方面所述突变型Taq酶的制备方法，其特征在于，将市售Taq酶基因的质粒定点突变，市售Taq酶基因的氨基酸序列为SEQ ID No.3，核苷酸序列为SEQ ID No.4，得到如第二方面中核苷酸序列为SEQ ID No.2的Taq酶质粒，将Taq酶质粒转化到感受态细胞中，从培养的细胞中分离纯化获得突变型Taq酶。
[0012]本专利技术的第五方面，提供了所述突变型Taq酶在扩增DNA样本中的应用。
[0013]本专利技术的第六方面，提供了一种PCR扩增试剂盒，含有如第一方面所述突变型Taq酶。
[0014]有益效果：
[0015]本专利技术通过突变氨基酸位点Q592K、S612R、A643L、V649L、A689I、F697I、和V720I，得到突变型Taq酶，在相同条件下的检测中突变型Taq酶的活性较市售Taq酶的活性有明显的提高，同时在热稳定性方面，突变型Taq酶较市售Taq酶有明显改善。
附图说明
[0016]图1为突变型Taq酶与市售Taq酶的SDS
‑
PAGE图；
[0017]图2为突变型Taq酶和市售Taq酶的活性检测结果图(2a为突变型Taq酶的活性检测结果，2b为市售Taq酶的活性检测结果)；
[0018]图3为热稳定性检测结果图(3a1，3a2为突变型Taq酶存放0天和30天后在同一浓度模板下检测得到的一组曲线，3a1为突变型0天，3a2为突变型30天；3b1，3b2为市售Taq酶在存放0天和30天后在同浓度模板下检测得到的一组曲线，3b2为市售Taq酶0天，3b1为市售Taq酶30天)。
具体实施方式
[0019]为了更好的解释本专利技术，下面结合附图，通过具体实施方式，对本专利技术作详细描述。
[0020]本专利技术公开了一种突变型Taq酶，还公开该酶的制备方法。本专利技术采用现代基因工程技术，将市售Taq酶氨基酸序列中的多个位点的氨基酸进行突变。
[0021]实施例1：Taq酶质粒的定点突变
[0022]将含有市售Taq酶基因(氨基酸SEQ ID No.3，核苷酸序列SEQ IDNo.4，GenBank:MG727867.1)的质粒，进行PCR扩增。合成的扩增引物即突变引物，包含了需要突变的位点，且已经替换了所需要突变的碱基。PCR扩增后，利用酶消化原来的母板，后将PCR的产物即含有突变后的Taq酶基因的质粒转化到感受态细胞中。挑选克隆即可得到含突变型酶基因的质粒。进行测序验证，基因测序得到的核苷酸序列如SEQ IDNo.2，证明突变后的Taq酶与设计的突变序列一致。
[0023]PCR扩增过程：
[0024]50μL反应体系：10
×
buffer(100mmol/L KC1,100mmol/L(NH4)2SO4，200mmol/L Tris
‑
HCl PH8.8，20mmol/L MgSO4，2％甘油)5μL，10mmol/L dNTP 0.5μL，突变引物各125ng，lU pfu酶，含50ng质粒模板1μL，加ddH20至50μL。
[0025]反应条件：94℃变性1分钟30s，循环周期为94℃20秒，60℃20秒，72℃15min，30个循环。PCR反应结束后将反应管放在冰盒上4℃降温。然后加入1μL的限制性内切酶Hind III(5'
‑
A
↓
AGCTT
‑
3')放置在37℃的恒温箱中酶解70min，消化掉未能突变的模板，最后将消化后的PCR产物转化到DH5α感受态细胞中。引物设计规则:引物中必须包含突变的位点，其它序列和原基因序列完全互补，且设计时引物长度控制在20
‑
45bp，尽量使得退火温度≥78℃。使得引物可以很好的和Taq酶基因结合，并且可以大幅降低引物多聚体的形成。
[0026]突变引物序列为：
[0027]Taq
‑
F：CCACCCCATCGTGGAGAAGAT(SEQ ID No.5)，
[0028]Taq
‑
R：GGTTGGGATCGGAGCTACTT(SEQ ID No.6)。
[0029]突变位点信息如下：
[0030]氨基酸突变位点为：
[0031]第592位由谷氨酰胺突变为赖氨酸，简写为Q592K；
[0032]第612位由丝氨酸突变为精氨酸，简写为S612R；
[0033]第643位由丙氨酸突变为亮氨酸，简写为A643L；
[0034]第649位由缬氨酸突变为亮氨酸，简写为V649L；
[0035]第689位由丙氨酸突变为异亮氨酸，简写为A689I；
[0036]第697位由苯丙氨酸突变为异亮氨酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种突变型Taq酶，其特征在于：所述突变型Taq酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。2.一种核酸，其特征在于：所述核酸编码如权利要求1所述的突变型Taq酶，所述的核酸具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。3.一种宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞含有如权利要求2所述的核酸。4.根据权利要求3所述的宿主细胞，其特征在于：所述的宿主细胞选自大肠杆菌DH5α感受态细胞。5.如权利要求1所述突变型Taq酶的制备方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：张胜有，任加庆，
申请(专利权)人：苏州赛普生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：