本发明专利技术公开了反转录酶HIV p66突变体及其应用。本发明专利技术将氨基酸序列为SEQ ID No.1所示的野生型反转录酶HIV p66同时进行D76A、R78K、W229Y、M230L、V75F和F77A突变得到氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的突变体。本发明专利技术还公开了所述反转录酶HIV p66突变体的编码基因、含有所述编码基因的重组表达以及宿主细胞。本发明专利技术进一步公开了制备所述突变体的方法。本发明专利技术所提供的突变体能够在面对特殊的RNA修饰和复杂二级结构的RNA的修饰也不会提前终止反应，与野生型反转录酶相比，本发明专利技术突变体具有更高的酶活，对含有m1A修饰的5
【技术实现步骤摘要】
反转录酶HIV p66突变体及其应用
[0001]本专利技术涉及反转录酶酶，尤其涉及反转录酶HIV p66突变体及其应用，属于反转录酶HIV p66突变体及其应用领域。
技术介绍
[0002]目前，大多数逆转录酶在面对特殊的RNA修饰（如m1A修饰）时会提前终止；面对复杂的RNA二级结构时，哪怕提高了反应温度，但反转录效率仍然很低；在碱性环境下升高反应温度还会导致RNA上的修饰改变，如m1A转化为m6A。
[0003]总之，现有的反转录酶大多数都不能完成对tRNA的反转录或者对于tRNA的反转录效率低下，极大限制了其在产业上的应用，亟待改进。
技术实现思路
[0004]本专利技术的目的之一是将反转录酶HIV p66进行突变获得对于tRNA的反转录具有高反转录效率的突变体；本专利技术的目的之二是提供反转录酶HIV p66突变体编码基因；本专利技术的目的之三是提供含有反转录酶HIV p66突变体编码基的重组表达载体以及含有该重组表达载体的重组宿主细胞。
[0005]本专利技术的目的之四是将所述的反转录酶HIV p66突变体作为反转录酶酶在将RNA反转录为DNA 中的应用。
[0006]本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的：本专利技术的一方面是将氨基酸序列为SEQ ID No.1所示的野生型反转录酶HIV p66同时进行D76A、R78K、W229Y、M230L、V75F和F77A这6个单位点突变得到突变体，突变体的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。
[0007]本专利技术所述氨基酸单位点突变“D76A”表示将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第76位氨基酸由天冬氨酸（D）突变成丙氨酸（A）；其余的单位点突变的表述依此类推。
[0008]本专利技术中所述的反转录酶HIV p66突变体的编码基因也属于本专利技术的保护范畴之内。
[0009]本专利技术的另一方面是提供了了含有所述反转录酶HIV p66突变体编码基因的重组表达载体或重组宿主细胞；其中，所述重组表达载体可以为重组原核表达载体或重组真核载体。
[0010]本专利技术的另一方面是提供制备反转录酶HIV p66突变体的方法，包括：（1）将反转录酶HIV p66突变体编码基因可操作的与表达调控元件连接构建得到重组表达载体；（2）将重组表达载体转化宿主细胞，培养宿主细胞，诱导表达重组蛋白，纯化，即得。
[0011]本专利技术所提供的反转录酶HIV p66突变体能够在较低温度下面对特殊的RNA修饰
和复杂二级结构的RNA的修饰（如m1A修饰）也不会提前终止反应，实现tRNA高效的反转录；与野生型反转录酶HIV p66或常规的反转录酶相比，本专利技术提供的反转录酶HIV p66突变体具有更高的酶活，对含有m1A修饰的5
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UTR序列或tRNA能够高效进行反转录。
[0012]因此，本专利技术所提供的反转录酶HIV p66突变体能作为反转录酶应用，包括：（1）将含有特殊修饰的RNA序列完整的反转录为DNA；（2）将tRNA反转录为DNA。
[0013]本专利技术所涉及到的术语定义除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本专利技术所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
[0014]术语“突变”和“突变体”在此具有它们的常用含义，指的是在核酸或多肽序列中的遗传的、天然存在的或引入的变化，它们的意义与本领域人员通常所知的意义相同。
[0015]术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”意指包含本专利技术多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。
[0016]术语“转化”指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。
附图说明
[0017]图1 HIV p66野生型与其突变体RT1306 RNase H酶活性比较。
[0018]图2对含有m1A修饰的5
‘
UTR序列进行反转录后扩增；注：图中的“本专利技术逆转录酶”为HIV p66突变体（RT1306）。
[0019]图3对tRNA进行反转录后扩增；注：图中的“本专利技术逆转录酶”为HIV p66突变体（RT1306）。
具体实施方式
[0020]以下结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。
[0021] 试验例1 HIV p66野生型和其突变体的RNase H酶活性比较试验供试生物材料：HIV p66野生型：其氨基酸序列为SEQ ID No.1所示；HIV p66突变体（RT1306）：将SEQ ID No.1所示的HIV p66野生型氨基酸序列同时进行D76A、R78K、W229Y、M230L、V75F和F77A这6个单位点突变，突变体的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。
[0022]试验方法（1）HIV p66野生型和突变体反转录酶纯化：诱导：2L LB扩增菌液到OD=0.6
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0.8，加入终浓度为0.5mM的IPTG， 37℃ 180rpm 2h，16℃ 180rpm 过夜诱导。
[0023]纯化：离心收集菌液，加入80ml冷的裂解液50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 0.5 M NaCl, pH 7.8和1X蛋白酶抑制剂。
[0024]超声波破碎，离心，4℃12000rpm30min。
[0025]加入10%PEI2.0ml4℃12000rpm15min。
[0026]使用裂解液buffer平衡Ni填料。
[0027]将上清加入至填料中，保持流速在30ml/h，即0.5ml/min流速。
[0028]清洗：使用清洗buffer（50mMNa2HPO4/NaH2PO4,0.5MNaCl,pH7.8）清洗至A280基线平衡。
[0029]洗脱：用含50
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500mM咪唑的洗脱buffer（50mMNa2HPO4/NaH2PO4,pH=6.0,0.3MNaCland10%glycerol）进行洗脱。
[0030]使用葡聚糖G25脱盐并置换buffer为50mMBis
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trispH7.0，50mMNaCl，样本再经Q6FF阴离子纯化柱纯化，并使用50mMBis
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trispH7.0,50mMNaCl清洗，收集流出液。
[0031]使用10KD超滤管置换buffer，浓缩并保存在50mMTris
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HCl,25mMNaCl,1mMEDTA,50%glycerol,pH7.0中。
[0032]SDS
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.反转录酶HIV p66突变体，其特征在于，所述反转录酶HIV p66突变体是将氨基酸序列为SEQ ID No.1所示的野生型反转录酶HIV p66同时进行D76A、R78K、W229Y、M230L、V75F和F77A突变所得到的突变体。2.根据权利要求1所述的反转录酶HIV p66突变体，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。3.权利要求1所述的反转录酶HIV p66突变体的编码基因。4.含有权利要求3所述反转录酶HIV p66突变体的编码基因的重组表达载体。5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体是重组原核表达载体或重组真核载体。6.一种制备权...
【专利技术属性】
技术研发人员：高伟，
申请(专利权)人：魔因生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：
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